| 抗菌肽（antimicrobial peptide）是生物体用来抵制外来入侵病原体，具有抗菌作用的一类小分子蛋白质或短肽，且在生物体内广泛存在。20世纪70年代瑞典科学家Boman H G在用大肠杆菌诱导惜古比天蚕（hyatophora cecropia）时分离得到世界上第一个正真意义上的抗菌肽———天蚕素（cecropin）。此后，人们相继从各种小到细菌大到高等动植物体内分离获得该类物质，其发现种类和数量也随着时间的推移而不断增加。 抗菌肽具有优良的广谱抗菌性能，对于革兰氏阳性菌和阴性菌都表现出良好的抑菌效果，且相对于抗生素具有效价高、无残留等特点，因此一直受到各国学者的广泛关注。随着基因工程和生物工程的发展，对于抗菌肽在体外的克隆和转载表达等研究也在积极进行中，各种转抗菌肽基因动植物及产品相继问世，为抗菌肽的大规模利用提供了一条前景广阔的道路。本文试图通过介绍抗菌肽的一些基本作用、获得方式及其在基因工程方面的研究进展，以期增加对该类物质的认识，并为今后规模化利用提供参考。1抗菌肽作用 1.1杀菌和抗菌 抗菌肽是一种“肽类抗生素”，对于各种革兰氏阳性菌和阴性菌都具有较高的抗性，可以杀灭侵入代写论文宿主体内的细菌或者抑制其生长繁殖。如人类防御素hBD-2对大肠杆菌及其它常见致病菌具有明显的抑制和杀灭作用，且活性比hBD-1高10倍（但有浓度限制，只有当超过100μg/ml时才能抗金黄色葡萄球菌）。目前，无论是人工合成还是生物提取的抗菌肽，均表现出较好的广谱抗菌性能，是传统抗生素较有潜力的替代品。 1.2抗病毒 抗菌肽能通过影响病毒的复制和转移,或直接杀灭病毒而发挥作用，已有许多研究证实了这点。如从嗜中性粒细胞中提取的Indolicidin在浓度为60～100 mg/ml的50%抑制剂量时对HIV-1型病毒（333 mg/ml）具有一定杀灭作用；caerin 1.1、caerin 1.9和maculatin 1.1三种抗菌肽可以抑制HIV的感染，阻断病毒向T细胞转移；防御素则可以使单纯疱疹病毒（HSV）、水泡性口膜炎病毒（VSV）、流感病毒（IV）失活等。 1.3抗肿瘤 Andersson M等首次发现NK-lysin具有抗肿瘤活性并得到后人证明，此后，人们加深了其在医学上的研究。究其抗肿瘤原因，可能与抗菌肽直接杀灭和抑制肿瘤细胞有关，如从欧洲林蛙（rana temporaia）分离出来的temporin L能诱导肿瘤细胞坏死，具有一定阻止肿瘤细胞扩散的作用；从鲎血细胞中提取的速普肽(又名中国鲎肽tachyplesin)和鲎肽(polyphemusin)则可以和整联蛋白结合序列RGD结合，破坏细胞膜并诱导细胞凋亡，以此来抑制肿瘤细胞和内皮细胞的增殖等。 1.4免疫调节 抗菌肽在适当浓度时以直接杀灭抗菌来发挥免疫作用，而在低于适当浓度时是以免疫调节的形式来保护生物体或者本身就只起到免疫调节的作用，调节免疫系统。如α-防御素能增强其巨噬细胞的吞噬作用，β-防御素则可以吸引T细胞、未成熟的DC和单核细胞至感染部位上起作用，诱发体液和细胞免疫应答，具有免疫增强作用等。 2抗菌肽获得途径 2.1生物提取 抗菌肽在生物体内广泛存在，因而生物提取法具有原料来源广、工艺相对简单、产量大的特点。目前，各国学者已从各种动植物组织和器官中提取出多种抗菌肽，如从非洲蟾蜍胃中可以提取出9种结构和性质不同，但均证明对大肠杆菌、白色念珠菌等革兰氏阳性菌和阴性菌有抑制作用的抗菌肽。此外，从蟾蜍皮肤中提取的magainin家族被证明是其重要的生理屏障，在皮肤破损情况下起抗菌作用，从而保证不被感染。 生物提取法包括有机溶剂提取法、水浸提法和有机酸提取法等，虽然具有众多优点，但是其尚未进入大规模应用阶段，主要是因为提取后杂质较多、提取率较低、成本相对较高。国内已有学者探索用加热-层析法提取蝇蛆抗菌物质，其抗菌肽得率为0.26%，虽然获得率较低，但却是海藻酸吸附法的52倍。未来生物提取法即是朝着获得率高、成本低的方向进一步发展,为工农业生产提供便宜、安全、可靠的抗菌肽产品。 2.2人工合成 随着人们对抗菌肽结构研究的深入，通过化学方法人工合成抗菌肽已经变为可能。而对于一些难以经生物提取的抗菌肽，通过化学合成也是一条比较好的解决途径，且合成的产品被证明同样在相应生物基质中具有优良的抗菌性能。P19(8)、D-P19(9/B)和L-P19(9/B)便是三种经过模板链编码、人工合成、纯化等一系列步骤获得的抗菌肽，虽然结构相似，仅存在3个残基差异，但是抗菌性能却不一样，对白色念珠菌的最小抑菌浓度（MIC）也不一样。 化学合成法尽管在生产上可行，但同样也存在合成费用高、产品纯度低和合成长链肽时效率较低的问题，因而使用受到限制，经过改进后，现行的工艺较以往有很大发展，但是仍不及通过基因和生物工程在体外表达的发展潜力。 2.3体外表达 通过转基因技术实现抗菌肽在体外的广泛表达是今后的重点研究和发展方向，具有广泛的临床和生产应用前景。如：牛气管抗菌肽（TAP）是牛体内重要生理屏障，保障气管不受感染，但是其有限的活性影响了在医药和农业上的应用。S YARUS通过转基因技术使得老鼠在乳中表达TAP，这种含有抗菌肽的乳对大肠杆菌等有害菌具有良好的抗菌性能，从而实现了TAP在体外的大量生产。 目前国内外已有研究和生产出多种表达体系和转基因动植物，所表达的抗菌肽种类也日渐丰富。尽管体外表达法是未来工业化生产抗菌肽的趋势，但应注意的是其仍然存在实验和生产周期相对较长、在后期提取和纯化过程中存在费用过高的问题。且经细菌表达体系表达时可能对宿主菌有杀伤作用、通过基因工程改造后的动植物是否存在排异等问题仍有待研究。 3抗菌肽的表达体系研究 3.1真核和原核生物表达体系 体外大量获得抗菌肽，需要利用不同的表达体系。目前，各种真核、原核生物表达体系已经比较成熟，所表达的抗菌肽种类和数量也较以前有很大丰富和提高。 3.1.1真核生物表达系统 3.1.1.1大肠杆菌表达体系 Yang等将人的阳离子抗菌肽hCAP-18/LL-37、凝血酶识别位点和硫氧还蛋白三者构建成表达载体pET-mh-CAP-18，然后在大肠杆菌中进行表达，获得的融合蛋白经凝血酶消化后形成重组的GSLL-39，重组的GSLL-39与其天然形式相比，在N末端多出2个氨基酸残基，但与其天然形式相似，具有抗革兰氏阳性菌和阴性菌的活性。李景鹏采用从pUC18载体上回收的防御素HNP-1外源基因片段，使其与载体pET30b连接，获得pET30b-I-INP-1重组质粒，并在大肠杆菌BL-21(DE3)中表达，发现人防御素融合蛋白得到表达，由此认为人防御素基因(HNP-1)可在大肠杆菌BL-21(DE3)株中表达，且目的蛋白在菌体内以包含体形式存在。 大肠杆菌表达体系是真核生物表达系统中研究较多的一种，具有一定简易性和大众性，国内外学者也取得了众多成果，但仍有一些缺陷，如：①缺少真核生物的蛋白质翻译后修饰和加工过程，表达后的抗菌肽活性受到影响；②表达的蛋白质多以包含体形式存在，不利于抗菌肽纯化和回收；③杂蛋白多，纯化步骤复杂等。 3.1.1.2杆状病毒表达体系 杆状病毒表达系统(baculovirus expression vectorsystem，BEVS)是近年出现的适用范围最广、表达效率最高的杆状病毒-昆虫表达系统之一，由转移质粒、线形化苜蓿银夜蛾核型多角体病毒（autographa califor-nia nuclear polyhedrosis virus，AcNPV）和草地夜蛾细胞（spodoptera frugiperda，Sf21）构成。杆状病毒也是抗菌肽基因工程原核表达中一种重要的表达体系，其发现时间比较早。在1991年，Andersons D就指出抗菌活性短肽（AMP）的表达体系即可以是杆状病毒，并使用该表达体系融合表达了抗菌肽cecropin。此外，Tanaka T将编码牛乳铁蛋白(bLF)的基因插入杆状病毒转移载体，分离表达bLF的重组病毒，使用抗bLF的单克隆抗体从重组的杆状病毒中检测到约80 ku的bLF相关蛋白，并且证明rbLF在氮末端含有糖蛋白结合位点，说明杆状病毒表达体系成功的表达了目的蛋白。 与大肠杆菌表达体系相比，杆状病毒表达体系具有操作相对简便、培养成本低、表达量高及所表达蛋白与天然蛋白特性相似等优势，具有较强的应用潜力。但目前后者的研究和报道以及所表达的抗菌肽种类较少，可能与杆状病毒宿主范围较窄有关。 3.1.2原核生物表达系统 3.1.2.1酵母表达体系 酵母表达体系是目前抗菌肽基因和生物工程中重要的、应用最为广泛的表达体系之一（其中应用较多的是赤氏巴斯德酵母），具有基因操作相对简单、外源蛋白能正确加工与修饰、表达量高、易大量发酵培养、易纯化等优点，国内学者在这方面做了大量工作，如：扈进冬等根据惜古比天蚕cecropin B成熟肽段的氨基酸序列，将其C端的甘氨酸用谷氨酰胺替代，选用酵母偏爱密码子人工合成cecropin B基因，并在毕赤酵母中成功地表达了cecropin B。此外，国外学者在酵母表达体系方面也有许多研究，如Heterologous蛋白质、elicidor蛋白质及Pisum sativum防御素1(Psd1)等均在毕赤酵母中成功表达。 应当注意的是转入基因的转录和表达的效率、宿主菌的种类和状态、内源蛋白酶的活性等因素均能影响外源蛋白在毕赤酵母中表达，所以在生产和试验中应注意选择。 3.1.2.2小球藻表达体系 小球藻(chlorella)属于绿藻门小球藻属的一种单细胞真核微藻，是近年来发展得较快的抗菌肽表达体系。以防御素为例，目前已有许多关于兔防御素基因在小球藻中表达的报道，如：Chen Y建立了单细胞真核藻类的高效表达系统，将兔防御素NP-1基因转入小球藻，体外离体抑菌实验证明NP-1基因已稳定整合到小球藻基因组中，并进行了正确转录和表达。小球藻能作为优良的生物反应器，培育转基因藻，从而正确表达所需蛋白，此外，各种因素，如随机整合与同源重组对外源抗菌肽基因表达也有一定影响，改变其表达后活性。 3.2利用转基因技术提高抗菌肽表达的研究 3.2.1表达技术 3.2.1.1人工合成编码基因，构建表达载体抗菌肽自身的氨基酸序列不长，通常只有几十个残基，因而其编码基因的cDNA序列也相对较短，只有几百个bp，甚至仅有几十个bp。利用以往文献报道的抗菌肽序列，参照一定设计策略，如改变α-螺旋的螺旋度、增加电荷数等，可以合成所需抗菌肽基因，从而进行转基因表达，避免了生物合成费时、费力的缺点。目前，已有多种合成的抗菌肽基因片段在体外成功表达的先例，如IL-2基因在大肠杆菌中的表达，国内有报道的有FcyRIIb1、SB基因等。这些基因片段长短不一，从几十bp到几千bp不等，显示出人工合成编码基因进行表达的强大潜力。 3.2.1.2融合表达 几乎所有利用微生物作为载体进行表达的方式都是融合表达，主要是因为转基因后表达的抗菌肽分子量小，容易被表达系统降解，且抗菌肽本身对宿主细胞有一定抑制和杀伤作用，会影响到后期表达。而以适合的蛋白载体来进行表达可以获得较高活性的抗菌肽，便于载体蛋白与抗菌肽的分离纯化，并且在大肠杆菌中也能得到高效表达。此外，还有众多抗菌肽基因采用的是融合表达方式，如人α-防御素基因、LL-37等。 就目前而言，现有的一些融合技术已经得到很大程度上的发展，但在重组细菌表达系统中，抗菌肽对宿主细胞具有毒性、易被降解、表达水平低等仍是困扰各国学者的难题。有研究者利用颗粒状病毒角蛋白作为新的融合物来生产AMPs,试验证明其加速了目标抗菌肽的产生，试验后纯化和回收率高，对大肠杆菌的抗性好，为今后采用新型蛋白作为融合载体提供了较好借鉴。 3.2.1.3杂合表达 一般利用抗菌肽N端的1～12位氨基酸序列基因片段合成一段基因，进而进行表达，获得新的杂合肽。实验证明，重组杂合肽对各类包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等革兰氏阳性菌和阴性菌具有较好的抗性，对于温度和pH值也有着较高的耐受性。Dmytro P将Cecropin A-melitin杂交肽基因转入烟草中，发现当受到真菌感染或者机械损伤时，其叶片的转基因表达会显著增加，而CEMA转录产物的积累则显著与之前的基因转入数有关,提示杂合肽表达存在着一定调控机制。此外，国内也有众多利用不同抗菌肽进行杂合表达的报道，如CecA-mil、天蚕素A-蛙皮肽基因等。 3.2.2转基因动物 将抗菌肽基因转入动物体内，目的有二：第一是为了获得高抗病性的动物个体，提高其抗病力；第二是为了获得含有抗菌肽的动物性产品，如乳类、血清等。目前，转基因动物研究主要集中在鼠类、牛等易于开展实验或试验产品大的动物，其它物种也正在积极研究之中。Reed W A采用融合表达方式，将抗菌肽基因Shiva la与小鼠IL-2基因注入原核期小鼠受精卵，发现在成熟小鼠的脾脏中能转录表达所植入抗菌肽，且小鼠的抗病力得到显著增强。同样，将人类防御素基因转入小鼠中，也能获得较高抗病性个体。抗菌肽转基因动物单从技术层面上分析，存在研发周期较长、成功率较低的问题，主要是因为外源的抗菌肽基因与所转入的生殖细胞或体细胞之间的整合情况无法得到保证，且在转入之前，也缺乏相应手段检测杂合基因或融合基因的整合情况。而使用动物乳腺作为生物反应器获得抗菌肽，虽然生长发育周期相对较长，但是其成熟生产周期长、产量大，所以仍然是目前使用得最多的手段之一。 3.2.3转基因植物 在植物生产中,人们将抗菌肽基因引入其中,均获得较高生产性能和抗病力的植株或物种,且相对于转基因动物,转基因植物的品种更为广泛，包含了各种农作物和经济作物,如对白叶枯病和稻瘟病菌有较强抗性的水稻、对早疫病和晚疫病有较强抵抗力的马铃薯等。以往在植物中是转入一种杂合基因或者融合基因来实现抗菌肽的转录表达,但Isabelle等研究出一种以可拆分的多聚蛋白表达方法,该多聚蛋白包含了一个前导肽和两种不同抗菌肽(DmAMP1和PsAFP2),在转入多聚蛋白结构后,受试植物Arabidopsis所表达的抗菌肽比单纯转入一种基因后表达的数量大得多，这为今后提高抗菌肽表达水平提供了一个良好借鉴。目前，获得转基因植物的方法有多种，如：①通过独立的转化途径逐个引入基因，与不同的单基因表达系杂交，但此方法不适用于无性繁殖的品种，如马铃薯和其它一些果树等。②通过连续的单基因转化引入新基因，此方法需要每一转化步骤都有可供选择的标记，因而使其变得更为复杂。还有其它一些方法，因使用受限或者研究较少，未能表述。 4结语 随着抗生素其它一些弊端和耐药菌株的出现，人们逐渐开始摒弃这类药物饲料添加剂，继而转向无残留、无毒害、具有良好广谱抗菌性能的抗菌肽，且抗菌肽较以往抗菌物质有着极为显著的优势，所以正受到越来越多的关注。从目前抗菌肽应用及其基因工程改良等方面来看，还存在一些问题有待解决。第一，无论是生物提取还是人工合成，如何尽量降低产品成本的问题。第二，抗菌肽在转基因表达过程中对蛋白酶较为敏感，如何解决易被分解的问题。第三，如何提高基因转导准确性、成功率的问题。第四，如何采取适当工艺提高产品回收率，降低回收成本的问题。相信这些问题逐渐为人们所认识并解决后，定能显著促进抗菌肽基因和生物工程研究的进一步深入，刺激该行业发展，从而为工农业生产和医学事业提供高效、安全、大量的抗菌肽产品。
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