花香是植物吸引传粉昆虫和抵制草食动物的一种进化适应。它不但对许多植物的生殖具有重要作用，而且在确保作物的产量和质量方面具有相当大的经济价值。此外，花香还能提高观赏植物和切花的审美价值。

由于花香气成分、结构及其生物合成过程比较复杂，如何快速准确地检测花朵的香味一直是困扰研究者的一个难题。在过去的20年中，由于气相色谱—质谱(GC-MS)、高压液相色谱—质谱(HPLC-MS)、固相微萃取(SPME)等现代微量化学分离分析技术的快速发展，使“顶空固相微萃取—气相色谱—质谱联检”(HS-SPME-GS-MS)技术成为目前最流行的测定430100)资助花朵挥发性物质的方法(Matich et al.,1996)。此外，红外光谱(IR)和核磁共振(NMR)技术也经常被用来检测植物挥发性物。近几年来，一种被称之为电子鼻(electronic nose)的装置开始被应用于香味物质的检测(Rakow and Suslick,2000)。随着分子生物学技术和生物化学技术的广泛应用，大量的编码花香物质合成酶的基因已被报道。在酶底物及其产物特异性的确定上，基因的体外异源表达使得花香物质的合成途径也得以清楚。此外，对这些基因时空表达模式的研究则进一步提供了调节花香物质释放的有关信息。近些年来，由于基因组学的兴起，使从表达水平上大规模地研究花香的代谢成为可能，从中发现了许多与花香形成相关的基因，这为人们了解花卉香味的形成规律，利用基因工程的手段培育芳香花卉新品种提供了理论依据。

1香味化合物的生物合成途径及相关酶和编码基因

1.1香味化合物的合成途径

形成花朵香味的挥发性分子种类繁多，它们是一类低分子量(通常在100~250 kD之间)低沸点、低极性的化合物，代写论文主要包括类萜(terpenoids)、苯型烃类(benzenoids)与苯丙素类(phenylpropanoids)、脂肪酸及其衍生物和一些含氮含硫化合物(Gang,2005)。萜类化合物是自然界中存在的种类最多的一类有机物，是形成花朵香味的重要物质，它们由若干个异戊二烯(C5)单元组成。萜类化合物的生物合成可分为4步：(l)形成C5单元异戊烯二磷酸(isopentenydiphosphates,IPP)。合成IPP的途径有二，一类是甲瓦龙酸(mevalonic acid,MVA)途径，主要负责倍半萜类的合成，该途径在细胞质中进行。另一类是甲基赤藓糖醇(methylerythritol)途径，该途径在质体中进行。主要负责半萜、单萜和双萜的合成(Dudarevaand Negre,2005)。这两条途径之间经常存在着物质交换(Schuhretal.,2003)。(2)IPP与其双键异构体二甲基烯丙基焦磷酸醋(dimethylallydiphosphate,DMAPP)在一系列烯丙基转移酶(prenyltransferases)的催化作用下，缩合成具C10骨架的香叶基焦磷酸(geranydiphosphate,GPP)、具C15骨架的法呢基焦磷酸(farne-syl diphosphate,FPP)和具C20骨架的香叶基香叶基焦磷酸(geranyl geranyl diphosphate,GGPP)，分别作为合成单萜、倍半萜和双萜的前体(Koyama and Ogu-ra,1999;Liang et al.,2002)。(3)这些中间体在属于一个大家族的一系列萜类合成酶(terpene synthases)的作用下，合成半萜、单萜、倍半萜和双萜(Cane1999;Wise and Croteau,1999)。(4)这些萜类化合物在细胞色素P450氧化酶(cytochrome P450 oxidases)、NADP/NAD的氧化还原酶(NADP/NAD-dependenoxidoreductases)和甲基转移酶(methyltransferase)等的作用下被氧化或甲基化进一步生成各种萜类衍生物，这些衍生物有的使原来没有香味的萜类产生了香味，有的增强或改变了原来萜类的香味(Du-dareva et al.,2004)。

苯型烃和苯丙素类由肉桂酸(cinnamic acid)途径合成。该途径以草莽酸(shikimic acid)为前体，经苯丙氨酸(phenylalanine)形成反式肉桂酸(trans-cinnamicacid)，苯丙氨酸解氨酶(pheammonialyase,PAL)在此过程中发挥关键作用(Ross et al.,1999)。反式肉桂酸经过一些甲基转移酶和酰基转移酶的作用而甲基化或酰化，形成一系列的挥发性化合物，催化这些反应的酶是一些甲基转移酶和酰基转移酶。上述的每一类酶都由基因家族编码。此外，苯丙素类物质还可以通过依赖乙酰辅酶A的β氧化和不依赖于乙酰辅酶A的非β氧化途径及异分支酸(isochorismate)途径减去两个C原子而转变为苯型烃(Boatright et al.,2004)。苯丙氨酸还可以在苯乙醛合成酶(phenylacetaldehydesynthase)的催化下直接生成苯乙醛(Kaminaga et al.,2006)。其他的一些香味化合物，如一些短链的醇和醛(通常为C6~12)，可通过磷脂或脂肪酸降解而产生，脂氧合酶(lipoxygenases,LOX)、过氧化氢物解离酶(hydrolperoxide lyases,HPLS)、异构酶(isomerases)和脱氢酶(dehydrogenases)等在此过程中发挥重要作用(Wildermuth et al.,2001)。挥发性含氮含硫化合物主要是由相应的氨基酸及其前体裂解生成(Goffand Klee,2006)，比如经色氨酸的前体吲哚-3-甘油磷酸(indole-3-glycerol phosphate)裂解即可生成挥发性的吲哚(Frey et al.,2000)。

1.2香味合成酶的相关基因

Pichersky等(1994)鉴定并分离纯化了仙女扇(Clarkia breweri)单萜挥发性物质(S)-芳樟醇的合成酶；Dudareva等(1996)从中克隆得到了其cDNA，这是花香相关基因克隆的第一篇报道。随后，IEMT、BEAT、SAMT、BAMT、BEBT、BSMT和苯乙醛合成酶(phenylacetaldehyde synthase,PAAS)等花香物质形成过程中的关键酶基因从仙女扇(Clarkia breweri)、金鱼草(Antirrhinum majus)、烟草野生种(Nicotian suave－olens)和矮牵牛(Petunia hybrida)等植物中相继被克隆(Wang et al.,1997;Dudareva et al.,1998;Ross et al.,1999;Dudareva and Pichersky,2000;Murfitt et al.,2000;D'Auria et al.,2002;Pott et al.,2004;Kaminagaet al.,2006)。利用功能基因组学的方法，从玫瑰中分离了OOMT1、OOMT2、RcOMT1、RcOMT2和POMT基因(Lavid et al.,2002;Wu et al.,2003;2004)；从矮牵牛(Petunia hybrida)中分离到了BAMT的相似基因BSMT、BPBT和新的花香调控基因ODORANT1(Negreet al.,2003;Boatright et al.,2004;Verdonk et al.,2005)。近几年植物基因组学的发展使得有关花香代谢的研究不再局限于一、两种模式植物。Aharoni等(2000)首次采用表达序列标签(EST)文库搜索结合植物挥发性成分谱，利用cDNA芯片分离了一个新的与芳香气味相关的醇酰基转移酶基因(SAAT)，该酶催化草莓果实挥发性酯类物质的合成。Channelière等(2002)利用表达序列标签对玫瑰花中基因表达得情况进行了分析，发现了几个在花和雄蕊中特异表达与花香代谢相关的基因，为下一步的研究奠定了基础。Guterman等(2002)用基因组学的方法研究了两种释放香气能力完全不同的四倍体玫瑰(Rosahybrida)(香气浓烈的FC和气味很淡的GG)的基因表达差异，完成了2 100个单拷贝基因的EST序列注释,并用基因芯片对其中一些选定克隆的表达模式进行了分析。通过对可挥发性物质的组成进行详尽的化学分析，并结合对表达同花香释放同步的一些次生代谢相关基因的鉴定，发现了一些花香合成相关的基因，并用大肠杆菌表达和酶活鉴定的方法进行了功能分析。对于脂肪酸类衍生物，Leon等(2002)采用共抑制沉默(co-supression mediated depletion)的方法，证实马铃薯(Solanum tuberosum)LOXH1基因编码的脂肪氧化酶(lipoxygenase,LOX)催化C6挥发性醛类的合成。而在拟南芥基因组全序列中已经发现了4个挥发性萜类合成酶基因，分别催化β-罗勒烯、月桂烯、芳樟醇和石竹烯的合成(Faldt et al.,2003;Bohlmann et al.,2000;Chen et al.,2003)，而经过广泛研究的信号分子茉莉酸甲酯合成酶基因也已被分离(Seoetal.,2001)。这些研究表明，尽管缺乏明显的气味，拟南芥也可作为研究植物挥发性物质代谢调控的模式。

2植物花香基因工程的策略

用于花香基因工程特定基因的选择取决于可获得的基因，育种目标(为人类消费的香味基因工程和目标昆虫授粉的香味基因工程)，以及虹吸初生代谢产物的同时，避免产生非育种目标的副作用的能力(Pichersky and Dudareva,2007)。随着一些植物次生代谢酶基因的克隆和植物基因工程技术的发展，采用分子和遗传手段来改变植物挥发性成分和气味组成的研究已经取得一定成果。

2.1引入外源基因

植物花香基因工程的一个策略是在已有代谢途径的基础上引入受体植物没有的香味物质合成基因。单萜是花香气的重要成分，研究表明单萜类物质的生物合成过程的关键步骤是在S-芳樟醇合成酶(linalool synthase,LIS)作用下，将香叶基焦磷酸(ger-anyl diphos phate,GPP)转化为3S-芳樟醇(3S-linalool)。3S-芳樟醇是一单萜醇类物质，具有甜的、令人愉快的香味，这种香味在许多物种中存在。编码S-芳樟醇合成酶的基因(Lis)已被克隆。在最初的尝试中最常用的基因是是来自加利福尼亚本土的一年生植物仙女扇的LIS基因(Dudareva et al.,1996)，在35S启动子的调控下，芳樟醇合成酶基因LIS在叶和花中都不能散发单萜的矮牵牛种间杂种和康乃馨中过量表达(Lücker et al.,2001)，从而使得在叶和花中合成芳樟醇。然而，合成的芳樟醇在转化株的花及其它部位都没有散发出香味。在矮牵牛中，大部分的芳樟醇被一种内生酶转化为非挥发性的芳樟醇-β-D-吡喃型糖苷(linalool-β-D-glucopyranoside)的形式存在(Lücker et al.,2001)。在转基因康乃馨中，大部分合成的芳樟醇被进一步代谢为挥发性的顺式或反式芳樟酯氧化物。这些早期实验提出了一个在花香基因工程必须考虑的额外问题，就是花香化合物被内生的，非特异的酶类修饰成非挥发性物质；或者释放的花香达不到能被人的鼻子检测到的水平，或者导入的花香成分被其它的挥发性物质所掩盖(Lücker et al.,2004)。令人鼓舞的是，在最近的实验中，通过导入3个柠檬单萜合成酶基因在组成型启动子35S的调控下成功使萜类化合物含量变化在烟草中得到实现(El-Tamer et al.,2003)。重要的是，产生的新的芳香化合物的释放水平足够被人的鼻子检测到。

采用果实成熟期特异表达的E8启动子，将仙女扇LIS基因转入番茄，成熟的果实合成并释放香气明显的S-芳樟醇和8-羟基芳樟醇，转基因植株的其他萜类代谢物如番茄红素、β-胡萝卜素和叶黄素等没有发生改变(Lewinsohn et al.,2001)。该结果说明利用挥发性物质代谢工程来改变果实风味是可行的。法国研究人员Pellegrineschi(1994)等利用野生型发根农杆菌转化带有芳香的柠檬天竺葵(Lemongeranium)，发现转化植株的芳香物质牻牛儿醇(geraniol)比对照植株增加了3~4倍，其他芳香物质如萜烯醇(linalool)和按树脑(1,8-eineole)在转化植株中也有较大的增加。这一实验为花卉香味基因工程研究提供了一条途径。

2.2调控内源基因的表达

花香基因工程的另一种策略就是调控内源基因的表达，包括对代谢途径的上游或者下游进行调控从而增加物质的合成，或通过阻断来自相同前体的其它物质的合成从而增加挥发性物质的生成。上游调控是指通过转入代谢途径上游的酶来增加前体的量，从而增加目的成分的合成。代谢前体是影响产物生成的主要因素之一，如金鱼草气味成分苯甲酸甲酯的合成就是由其前体苯甲酸的量所控制的(Du-dareva and Pichersky.,2000)。Wang等(2001)将酵母Δ9去饱和酶基因转入番茄(Lycopericon esculentum)后发现叶片内脂肪酸成分发生变化，从而导致产生以脂肪酸为底物的1-羟基-2-丁酮、1-戊烯-3-醇、庚醛、3-己烯-1-醇、2-辛醇、(Z)-3-己醛、正己醛、2-壬醛等绿叶挥发物的释放量增大了3倍，但是其它一些非脂肪酸代谢产物如2-乙基-呋喃、丁子香酚等的量也有了较大的增加。向辣薄荷(Menthapiperita)转入萜类代谢途径上游的DXR基因，转化植株中挥发油的产量比野生型植株增加了50%，而精油中单萜的相对含量没有改变。有趣的是一些转基因植株产生叶绿素合成缺陷表型，在这些植株中检测不到DXR转录本和酶活性，表明转入的基因与内源DXR基因产生了共抑制。下游调控指直接引入催化代谢产物合成的酶基因，从而增加产物的合成速率，而并不改变代谢途径中前体的量。将留兰香(Menthaspicata)4S-柠檬烯合成酶基因(4S-LS)转入田野薄荷(M.arvensis)和辣薄荷(M.piperita)植株，两种转基因植物中单萜含量都发生了量的改变，4株辣薄荷总萜含量增加而2株田野薄荷(M.arvensis)的单萜含量降低，说明由于引入了4S-LS分别产生了共抑制和过量表达(overex-pression)(Diemer et al.,2001)。脂肪酸过氧化物裂解酶(HPL)是催化以脂肪酸9-过氧化物为底物的C9醛类生成的反应的酶，将它的基因转入番茄，在转基因植株叶片和果实中可以检测到较高的HPL活性；在果实匀浆中加入该酶底物亚油酸，就生成大量的挥发性C9醛类(Matsui et al.,2001)。竞争调控指通过阻断其他相关代谢途径，从而改变代谢物质组成，增加目的产物的合成。苯甲酸和花青素均来自苯丙烷类代谢途径，花青素途径的阻断可以使苯甲酸途径上的代谢流增加。比如，对花青素途径上的一个关键酶基因黄酮3-羟化酶(F3H)进行反义抑制，使其表达和酶活性大大减弱，使康乃馨(Dianthus caryophyllus)转基因植株除了花色发生改变外，还增加了香味成分甲基苯甲酸合成量，并能被人的鼻子感觉到(Zuker et al.,2002)。

2.3引入外源转录因子

近年来，转录因子在调控花香代谢途径中的作用越来越受到重视。Verdonk等(2005)在矮牵牛中发现并鉴定了R2R3-type MYB转录因子家族的一个基因ODORANT1(ODO1)，它能够调节苯型烃类挥发性物质的生物合成。利用RNAi技术抑制其表达时，通过使草莽酸途径的前体物质合成减少从而导致苯型烃类花香成分的释放显著降低，但没有影响花色的合成。Ben Zvi等(2008)将能够调节非挥发性物质苯丙素类产生的拟南芥Myb转录因子Pap1(production of anthocyanin pigment1)转化矮牵牛获得了稳定表达的转基因植株，除了使花色增深外，还使挥发性的苯型烃类与苯丙素类复合物的含量增加了10倍。这表明Pap1转录因子促使代谢流增加、花香和花色基因的转录增强，从而导致矮牵牛花香和花色增强。随着更多转录因子被发现，通过调节代谢途径的的流向使花卉香味增加，提供了一个新的花香基因工程策略。

3花卉香味基因工程的影响因素

除了基因本身外，香味等挥发性物质的合成和释放还受到其调控模式的影响。大量香味基因的克隆使在分子水平上研究花朵香味的时空调节成为可能。通过测定酶活性、酶蛋白含量和相关基因的mRNA水平，研究者发现了香味产生的发育调节(开花期香味达到最高峰)昼夜周期主要由相关基因的表达所调控(Negre et al.,2003;Dudareva et al.,2004;Verdonk et al.,2005)，但其中转录水平调节、翻译水平调节和翻译后水平调节分别占多大比例还不清楚(Deschamps et al.,2006)。

在仙女扇中，3种主要的挥发性物质释放量主要是由各自合成酶活性决定的(Dudareva and Pichersky,2000)。矮牵牛BPBT的转录有节律地变化，在下午达到最高点，早于其产物苯甲酸苄酯(benzylbenzoate)出现的最高点(Boatright et al.,2004)。Kolosova等(2001)发现白天释放挥发性物质的金鱼草(Antirrhinum ma－jus)和夜间释放挥发性物质的矮牵牛(Petunia hybridaL.)、烟草(Nicotiana suaveolens L.)的主要挥发性物质苯甲酸甲酯具有相似的分子调控机制。苯甲酸甲酯的释放节律表现为一种周期性的“自由振荡”(free-running)特征，受环境因素影响较小，苯甲酸羧基甲基转移酶(BAMT)的活性并不是决定这种周期性变化的直接原因，其底物苯甲酸量的变化才是最主要的因素。然而，苯甲酸的合成是如何调节的还不清楚，可能与PAL活性的节律调节有关(Kolosova et al.,2001)。Ver-donk等(2003)利用矮牵牛W115系(mitchell)对SAM合成酶(S-adenosyl methionine synthase)和PAL的研究表明，矮牵牛中苯型烃类可挥发物的周期释放(黄昏时最高)至少部分是在转录水平上被调节的，并且相关合成基因的上调表达在时间上要早于挥发物的释放。

有时调节花朵香味发育表达的关键并不是某香味成分合成途径最后一步的酶，此时上一步的底物供应是否充足在决定香味物质最终能否合成中起主导作用(Tholl et al.,2004)。特别是当某一种酶，如S-腺苷甲硫氨酸：水杨酸羧基甲基转移酶(S-aden-osyl-l-Met：salicylic acid carboxyl methyltransferase,SAMT)和乙酰转移酶(acyltransferases)等，可以催化多种底物时，此时各种底物的浓度往往决定了代谢的流向和最终产物的种类，从而最终决定了花香是否产生(Negre et al.,2003;Boatright et al.,2004)。比如，玫瑰乙醇乙酰基转移酶(alcohol acetyltransferase,RhAAT)可以催化底物香叶醇(geraniol)和乙酰辅酶A形成乙酸香叶酯(geranyl acetate)，当它由35S启动子驱动在矮牵牛中表达时，它利用内源的苯乙醇(phenylethyl al-cohol)和苯甲醇(benzyl alcohol)作底物，使乙酸苄酯(benzyl acetate)和乙酸苯乙酯(phenylethyl acetate)的释放量显著增加(Guterman et al.,2006)。

花卉香味基因工程的成功与否还与启动子的选择存在着密切的关系。在两种山字草属植物仙女扇(Clarkia breweri)和优雅春再来(C.concinna)中芳樟醇合成酶基因(LIS)都有存在，后者基本没有气味而且LIS仅在柱头中表达。对两者启动子序列比较时发现，后者在推测的TATA box和CAAT box上游有插入片段，而其它序列则完全一致。因此，可能是由于启动子差异导致最后芳樟醇的释放量大不相同(Cseke et al.,1998)。

如何快速准确地检测花朵的香味，在相当长的一段时间内仍将会是研究者需要探索的重要难题。为人类消费的香味基因工程可以依靠人的感觉器官来评价，但由于人类对气味的灵敏度远远不及动物或昆虫的感官(Vosshall,2000;Stockhorst and Pietrowsky,2004)，在以目标昆虫授粉的香味基因工程的评价标准不能依靠人的感觉器官来评价的。遗憾的是，花香的改变对昆虫和动物的吸引力的影响至今还没有研究报道。

4展望

由于花香气成分、结构及其生物合成过程比较复杂，与植物花色、花期等其它观赏性状的遗传改良相比，近年来植物花香基因工程虽然在通过对代谢途径的主要限速酶基因或转录因子修饰上，从而改变代谢流的方向的研究上取得一些成果。然而，由于植物代谢的复杂性和种属特异性，花香物质代谢基因工程还有许多问题。例如，一些目标基因的超表达或抑制，并未提高预期代谢产物的合成量，有的则产生相反的结果，而有的则合成新的物质或其他非目标产物。

在不同转化体或不同种类植物中，还存在目标转基因表达水平差异大，限速酶基因表达及酶活性高低与目标产物合成有时不一致等问题(孙明等,2007)。因此，通过基因工程改造花朵香味的工作还有大量问题需要解决，实践证明，通过改造某一个酶试图达到预期效果的可行性相当低(Dudareva andNegre,2005)。在萜类和苯丙素类物质及其衍生物中，除了花香物质外还有大量的生理活性物质(如脱落酸)，因此在改造相关代谢途径的过程中，还可能会发生一些意想不到的代谢紊乱，采用花朵特异表达启动子控制相关酶的表达可能会降低这一问题发生的概率(缪昊抿等,2007)。

可以预见的是，从更多的具有香味的植物中鉴定更多的花香物质、采用传统方法和高通量方法阐明更多的香味物质合成途径、克隆更多的相关酶基因等等工作还是今后一段时间的主要工作。考虑到花朵香味的混合特性，众多香味物质的合成或停止合成是如何受到空间、发育阶段和环境条件协同调节的(特别是合成途径完全不同的物质)，将是研究者面临的一大难题。各种高通量方法(包括系统生物学和代谢组学)的运用和上游关键调控因子的发现可能会有助于该问题的解决(缪昊抿等,2007)。

在数十年乃至数个世纪的花卉选择育种过程中，人们往往着重于对花卉外观和外形的选择而忽视了对香味的选择，导致了许多现代花卉缺乏明显的香味，特别是以花形和花期为主要选择目标的鲜切花育种。我国的许多传统花卉如中国兰花和中国水仙花虽小，颜色简单，却具有极其浓郁的芳香。而现在的许多切花花卉(如月季、康乃馨等)、附生兰类(如蝴蝶兰等热带兰)和水仙属植物的花虽大，色泽鲜艳，却大多没有芳香。因此，利用花香基因工程进行香花植物的转基因育种具有重大的经济价值和观赏价值。随着对植物花香物质代谢途径的全面解析和相关基因的克隆，以及现代生物技术的不断进步，植物花香基因工程在改造现有植物性状，培育色香型俱佳的观赏植物的育种实践中将发挥越来越重要的作用。