纤维素是地球上最丰富且可再生的生物聚合物,是由D-吡喃式葡萄糖基通过1,4-β-糖苷键连接而成的线性不分支的同聚多糖[1]。纤维物质由于结构复杂任何单一的酶都难以将其高效水解。因此,能水解天然纤维素的纤维素酶都是复杂的多酶体系。经过二十多年的不断研究,纤维素酶分离纯化的方法不断改进,组分越分越细,不同酶组分的作用机理正逐渐被阐明[2]。同时,由于纤维素酶作用的底物比较复杂,反应产物不同,致使纤维素酶活力测定方法很多。近年来随着生物化学、分子生物学以及基因工程等多种交叉学科的快速发展,相关领域的研究出现了更多更新的纤维素酶活测定以及动力学研究方法。

1　纤维素酶系的分类组成

　　一个完整的纤维素酶系,通常由作用方式不同而能相互协同催化水解纤维素的三类酶组成,即(1)内切葡萄糖苷酶(endo-1,4-β-D-glucanase,EC3. 2. 1. 4,简称EG)。这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区,随机水解β-1,4-糖苷键,将长链纤维素分子截短,产生大量带非还原性末端的小分子纤维素。(2)外切葡萄糖苷酶(exo-1,4-β-D-glucanase, EC3. 2. 1. 91),又称纤维二糖水解酶(cellobioh·rolase,简称CBH)。这类酶作用于纤维素线状分子末端,水解β-1,4糖苷键,每次切下一个纤维二糖分子。(3)β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,EC3.2.1.21,简称BG),这类酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子[3]。

　　纤维素酶属于糖苷水解酶。随着糖苷水解酶的氨基酸序列和3D结构研究的不断增多,以及各种催化残基鉴定方法出现,在氨基酸序列相似性基础上确立的新的糖苷水解酶分类方法将糖苷水解酶分为111个族,纤维素酶占其中的16个族。对5,6,7,9,45族的催化机制和功能氨基酸的研究成果较多。依据Carboh·rate-Active enzymes (法国,有关碳水化合物和酶的数据库)以及相关文献[4],表1列出了糖苷水解酶类纤维素酶分族的催化核心、作用机制、空间结构以及与传统纤维素酶分类的关系等信息。

2　纤维素酶活性的检测方法

　　纤维素酶是多组分复合物,各组分的底物专一性不同。不同来源的纤维素酶其组成及各组分的比例有较大的差异,代写论文同时纤维素酶作用的底物也比较复杂,致使纤维素酶活力的测定方法复杂而不统一。以下从传统检测方法和传感器检测方法两方面分别给与说明。

2.1　传统检测方法

　　曾报道过传统纤维素酶测定方法很多,如滤纸酶活(FPA)测定方法、羧甲基纤维素钠盐(CMC-Na)酶活性测定方法、微晶纤维素酶活测定方法、水杨苷酶活测定方法、棉花糖法、CMC粘度降低法、荧光定糖法、染色纤维素法、滤纸崩溃法、棉线切断法、平板法。

　　纤维素酶系总的糖化能力的测定常见有3种[5~7]:一是滤纸酶活(FPA)测定法。滤纸是聚合度和结晶度都居“中等”的纤维性材料,以其为底物经纤维素酶水解后生成还原糖的量即可表征纤维素酶系总的糖化能力。此方法应用广泛,反映了三类酶组分的协同作用。二是荧光法。根据还原糖与反应液生成荧光物质,通过测定荧光物质的荧光强度的大小来计算其还原糖的含量。三是滤纸崩溃法。在容器内加入缓冲液和适当稀释的酶液,放入一定尺寸的滤纸条,一定温度条件下反复振荡,以滤纸完全崩溃为粉末状所需的时间来表征纤维素酶的活力,该法的研究相对较少。

　　内切葡萄糖苷酶活力的表征主要为CMC-Na酶活性测定方法[8]。纤维素酶中内切葡萄糖苷酶对CMC-Na有降解能力,生成葡萄糖等还原糖,通过DNS法显色,用标准葡萄糖溶液作标准曲线,使用分光光度计测其吸光度,以每分钟生成相当于1μmol的葡萄糖所需酶量定义为一个酶活性单位。

　　外切葡萄糖苷酶活力的测定方法主要有[9,10]:一微晶纤维素酶活测定方法;二棉花糖化法。两者均利用纤维素酶降解微晶纤维素、棉,采用DNS显色法,通过计算还原糖的量来表征外切葡萄糖苷酶活力。

　　β-葡萄糖苷酶活性的测定常用方法[11,12]有3种:一是Barush和Swiain法。它以水杨苷作底物,酶解产物用4-氨基安替比林作显色剂,使释放出来的水杨醇显色(或DNS显色),再用分光光度法比色测定;二是荧光法。利用伞形酮(7-羟基香豆素)与4-甲基伞形酮具强烈荧光的特点,将它们衍生为无荧光的底物,以此测定;三是以对-硝基苯-β-葡萄糖苷为底物进行酶解,底物水解后释放出的配基对-硝基苯酚可直接在400~420 nm波长范围内测定。

　　通过DNS显色的测定方法具有操作简便、成本低廉、便于大批量以及测定相应水解酶的Km值等特点,而吸收光谱的确定、显色剂用量与配制、显色时间、稳定时间、底物本身特性诸多因素将直接影响测定的结果,使得检测重现性较差,此外为提高准确性测定时样品、空白样以及标准曲线需同时进行显色比色。硝基苯-β-葡萄糖苷显色法与DNS法区别在于消除了显色剂本身颜色所带来的误差。滤纸崩溃法则免去了繁杂的显色分光光度检测过程,却使得所测结果可靠性不及前者。荧光定糖法灵敏度高,专一性较强,检测还原糖含量线性的范围却低于DNS法,比较适于低浓度纤维素酶活力的大量样品的测定。荧光法测定β-葡萄糖苷酶利用甲基伞形酮具有强烈荧光取代对硝基酚衍生物做为一些水解酶的底物,可将灵敏度提高2~3个数量级。但荧光法不易掌握,对所用的试剂、容器和仪器都要求很高,否则易产生非特异荧光干扰测定,或者引起荧光的淬灭使测定不准,故此方法多用于研究实验室,少用于常规实验室。

2.2　传感器检测方法

　　生物传感器是在生命科学和信息科学之间发展起来的一门交叉学科。最早的生物传感器发明于1962年,Clark等[13]利用不同的物质与不同的酶层发生反应的工作原理,在传统的离子选择性电极上固定了具有生物功能选择的酶,从而构成了最早的生物传感器———“酶电极”。生物传感器研究的全面展开是在20世纪80年代。20多年来,生物传感器逐步进入全面深入研究开发的时期,各种微型化、集成化、智能化、实用化的生物传感器及系统越来越多。

　　近半个世纪以来,人们一直沿用前述传统方法进行还原糖以及多糖水解酶的酶活测定。虽然该类方法操作相对简便、快捷,但与新型先进技术相比还是存在一定缺点,如有颜色底液严重干扰,实验步骤复杂,灵敏度低,重现性差。因此研究灵敏可靠、选择性好的纤维素酶活测定方法一直是纤维素化工中亟待解决的问题。而生物传感器以其具有高灵敏度、高专一性、快速测定、简便易携、适应于复杂体系的实时及在线测定、检测样品一般不需要预处理、不需另加其它试剂、可反复多次使用、不要求样品清晰度等优点,在监测与控制中显示出巨大的优势。目前国内外已有少数传感器应用于纤维素酶酶活的检测以及动力学研究。

2. 2. 1　压电生物传感器　压电生物传感器

(piezoelectric biosensors)是近二十年来发展起来的一种新型生物传感器。它主要是利用压电石英谐振器对质量的敏感性,通过监测谐振器吸附待测物后频率的变化来检测待测物。这类传感器最大的优点是不需要任何标记、仪器简单、操作方便、具有响应灵敏、选择性好、便于自动化等优点,因此引起了人们的浓厚兴趣,成为生物传感器领域的研究热点之一[14]。

　　Orlando等[15]将特制纤维素薄膜置于石英晶体微天平上,纤维素酶液通过微量注射泵缓慢注入传感器中,监测酶与纤维素膜作用中频率及能量耗散的改变,旨在研究纤维素酶与底物结合及水解动力学变化过程。结果表明纤维素酶与底物结合过程可用指数函数表达,纤维素的降解过程符合波尔茨曼-S型动力学模式,且水解动力学参数和传统方法相近。Deliang等[16]以纤维素酶与底物CMC酶水解过程建立一种体声波纤维素酶传感器,将CMC、缓冲液以及纤维素酶均匀混合一定时间,在酶水解过程中根据频率变化从而获得动力参数。结果表明温度30℃, pH 5.0时,水解速率最佳,得出动力学参数Km, Vmax,同时测定水解活化能。传统酶解动力学研究通过测定不同浓度底物反应时的酶活力,根据葡萄糖标准曲线得到还原糖含量,对还原糖含量-酶解时间曲线进行二次拟合L-B法作图,取得动力学参数V0,Km,Vmax。压电传感器检测免去了繁琐的操作过程,运用传感器自动化检测,在短时间内能得出与传统方法相一致的结果,更重要的是能深入研究整个酶解动态过程。

2.2. 2　电化学生物传感器　电化学酶传感器主要由固定化酶膜和电极组成。固定化酶膜可以选择性地“识别”被检测的物质,并且催化被“识别”出的物质发生化学反应,电极则把这一催化反应中底物或产物的变量转换成电信号,进而通过仪表显示出来。　　干宁等[17]用TiO2凝胶包埋葡萄糖氧化酶电化学传感器(GOD/TiO2)测定纤维素酶的活性,基于电极对羧甲基纤维素钠水解后生成葡萄糖的催化氧化。GOD/TiO2电极在含CMC-Na、电子媒介体二茂铁六氟磷酸盐(FcPF6)的磷酸盐缓冲溶液中检测,整个反应过程可表示如图1。加入纤维素酶后传感器10 s达到最大响应电流的90%。稳态响应电流与纤维素酶活性在10~300U/L之间有线性关系,最低检出限为3. 0 U/L。该法可用于微量羧甲基纤维素酶活性测定。与DNS法对比,实验结果表明使用此法和传统方法并无显著差异。　　Hirosuke[18~20]利用吡咯喹啉醌-葡糖脱氢酶(PQQ?GDH, EC 1.1.5.2)研究纤维二糖水解酶(CBH)作用于纤维素底物的动态分析。由于PQQ?GDH对葡萄糖以及二糖表现出明显活性,将其固定于含对苯醌的碳糊电极。在缓冲液中连续滴加纤维二糖,传感器能在1min内电流值至稳态,纤维二糖检测限为1μmol/L。随后将CBHI加入含纤维素溶液中,电流迅速变化,CBH水解纤维素过程符合吸附、反应、解吸三步骤机理。此外,该课题组还将葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3)电化学传感器直接应用于高浓度淀粉溶液研究酶水解动力学过程。同时利用电化学葡萄糖氧化酶传感器研究葡糖淀粉酶催化水解不同植物性材料的动力学过程,得出淀粉颗粒对水解有影响:颗粒减小,水解速率相应增大。李静[21]等用铂纳米簇、聚毗咯、聚邻氨基苯酚修饰玻碳电极,然后固定葡萄糖氧化酶制成葡萄糖传感器葡萄糖电化学传感器能在7s内得到响应,葡萄糖浓度线性范围达到1.5×10-6~1.3×10-2mol/L,最低检测限能达到4.5×10-7mol/L,有较好的抗干扰性及重现性。相比之下,传统检测方法检测上限略高于此类方法,但其灵敏度、精确度、重复使用方面均存在确明显差别。

3　纤维素酶编码基因及表达的检测

3.1　编码基因及表达调控

　　在纤维素酶基因的克隆领域,已有11个纤维素酶基因得到克隆并测序,包括编码纤维二糖水解酶的cbh1, cbh2和cbh3和编码内切葡聚糖酶的eg1, eg2,eg3, eg4和eg5,以及编码β-葡萄糖苷酶的bgl1、bgl4和它的类似物bgl2(两者有73.1%同源性)[22]。　　在纤维素酶基因的表达调控方面,研究较多的是木霉属的纤维素水解酶类的表达与调控。其中里氏木霉[23](Trichoderma reesei,简称T. reesei)作为产生纤维素酶和降解纤维素的模式菌株,它产生的纤维素酶能够利用和降解复杂的纤维素底物,因而在其产的纤维素酶表达调控方面已有大量的研究。里氏木霉产生纤维素酶的调控是在转录水平进行的[24]。TrichodermareeseiQM9414的纤维素酶基因(CBHI, CBHII, EGI,EGII,和EGV)在转录因子的作用下协同表达。里氏木霉纤维素酶基因中已研究过的有8个[25]:编码纤维二糖水解酶的cbh1, cbh2,编码内切葡聚糖酶的eg1,eg2, eg3, eg4, eg5以及编码葡萄糖苷酶的bgl2,这些基因均已在大肠杆菌(Escherichia coli,简称E. coli)中得到表达。

3.2　检测方法

3.2.1　DNA传感器　DNA传感器是一种伴随着基因工程技术发展而开发出来的一种新型生物传感器。与酶和抗体不同,它的生物识别元件采用DNA或肽核酸探针。其设计原理是在电极上固定一条含有十几到上千条核苷酸的单链DNA,与另一条含有互补碱基序列的DNA识别形成双链DNA。换能器将杂交过程所产生的变化转变成电信号,根据杂交前后电信号的变化量,推断出被检测DNA的量,从而达到对目标物的研究[26]。

　　DNA传感器已广泛应用于医学、食品、环境等众多方面。如杜宗敏等[27]针对鼠疫菌的caf1基因设计并合成一对PNA探针,分别与链霉亲和素包被的磁性纳米颗粒和cy5荧光纳米颗粒结合后,利用荧光扫描技术检测样品中的鼠疫菌。荧光信号强度与靶分子浓度在1.8~18μg/ml范围内有较好的相关性,相关系数r为0.9914,检测的灵敏度为0. 9μg/ml(待测DNA)。但该检测方法的灵敏度和特异性较荧光定量PCR和常规PCR方法有一定的差距,作为一种新技术经过改进,有望能与前述两种方法媲美。Marian等[28]制备含羧基的十八酸碳糊电极共价结合含磷酸基团特异ssDNA序列,根据指示剂Co(bpy)33+产生电化学信号检测样品中bar基因ssDNA,定量定性分析植物中编码抗除草剂转基因中bar基因。结果表明, ssDNA线性浓度范围为5~20μmol/L,最低检测限为0. 1μmol/L,整个检测全过程只需70min。

　　生物传感器在堆肥的过程控制和动态监测的研究中极具意义:可以运用传感器对堆肥过程中某种微生物浓度及分布、某种酶的降解活性及随培养条件的变化、某种微生物核酸片段的定量分析、腐熟度(含多种有机物浓度)、有毒有害污染物的浓度等进行监测。生物传感器能达到准确检测痕量物质的目的,如在堆肥体系中检测有害、有毒物质等。汤琳等[29]人成功将DNA传感器运用于堆肥中检测,设计白腐菌编码木素过氧化物酶编码基因特异性探针,固定在金电极上检测堆肥中目标序列,基于酶联放大电化学传感器用于检测高效降解菌产酶基因在堆肥体系中的表达情况,并取得较好的检测效果。同时,DNA传感器运用于构建纤维素酶工程菌中功能基因表达检测方面中也应会起到无可比拟的效果。随着纤维素酶各种组分基因研究的日益完善,纤维素酶基因重组技术逐渐成熟,DNA传感器应用于纤维素酶检测也会应运而生。本课题组根据纤维素酶各种不同组分酶DNA序列设计出各种亚酶系的特异性探针,通过电化学检测电信号对城市生活垃圾堆肥过程中纤维素降解酶系的传感器检测的跟踪监测,研究纤维素酶系的动态过程研究及其表达情况。相比前述的两大类传感器,只需微量样品就可通过电化学、石英微天平或者荧光仪器得到精确的检测结果,大大降低有毒试剂的消耗,减少环境污染。现有传感器技术能在数秒内完成检测且最低检测浓度可达到10-14mol/L,从而实现了在复杂体系中依据特异性结合来精确检测目标DNA。

3.2. 2　基因芯片　基因传感器发展的一个具有重要意义的趋势是构制微型基因传感器阵列即基因传感器芯片( gene chip),又称基因微矩阵(microarray),其原理是将大量特定的基因片段或寡核苷片段作为探针有序地和高密度地排列固定于玻璃或膜等载体上,然后与有标记的待测样品核酸按碱基配对的原则进行杂交,最后检测出结果[30]。由于基因芯片能够同时检测几万个基因的转录水平,因此可检测不同条件下差异表达的基因,了解这些基因的表达调控和功能。同时,其以高通量、并行、快速等特点,解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂、自动化程度低、检测序列少、效率低的缺点。

　　基因芯片已在植物学、动物学、医学和农学等多个研究领域中发挥了重要作用。如在病毒检测中,Bruant等[31]设计出检测E. coli189个毒力基因和30个耐药性基因的寡核苷酸基因芯片。在真菌检测方面,黄爱华等[32]以5.8S rDNA与28S rDNA间的内转录间-2为靶标,针对待检的临床常见致病真菌设计合成一系列寡核苷酸探针,制成基因芯片。该研究建立的基因芯片技术可以有效地区分20种临床常见致病真菌,特异性良好,重复性良好(信噪比CV <10% ),灵敏度为15pm/ml真菌DNA。Franke-Whittle等[33]依据16S rRNA设计探针基因微矩阵用以检测堆肥中微环境,探针涉及堆肥中的植物、微生物、致病菌等,并利用荧光标记检测信号。

　　研究中发现,纤维素酶存在多型性。具体表现为[34,35]酶系组成的多型性、酶蛋白结构形式的多型性、理化性质上表现的多型性、酶分子结构和功能的多型性。究其成因,首先在于结构基因的不同。如T. reesei的CBHI和CBHII两组分既无同源性也无免疫相关性;其次为翻译后的修饰与加工。如在实践中,如果对某一酶组分再作进一步的分离,就会发现,这些组分又是由许多亚组分组成的;再次则是表观的多型性。这种多型性并不是由于酶分子结构的变化造成的,而是因为酶分子与其它酶组分或效应物结合形成复合体。因此,在纤维素酶的多型性以及前人对基因芯片研究的基础上,全面检测纤维素酶各组分之间的作用以及整个体系间相互协同作用,并最终将能通过基因芯片以达到检测目的。

4　结论与展望

　　纤维素酶是多组分复合物。不同来源纤维素酶,其组成及各组分的比例有较大的差异。随着分子生物学等学科的发展,在分子领域中人们对纤维素酶有更新的研究与认识。仅运用传统方法对其研究已是远远不够的。而传感器作为近年发展起来的可对所分析物质进行快速、准确、实时检测的新方法,其灵敏度高、选择性好、操作简单,正逐步趋向微型化、阵列化,从单一测定发展成同时测定多种物质,传感技术也不断更新,越来越广泛地应用在研究监测领域中。在线快速灵敏的传感器运用在检测纤维素酶酶活及其动力学、基因表达方面的研究将成为一个新的发展趋势,克服了传统方法灵敏度低、重现性差、易受干扰等缺陷。

　　然而,在实际生产中运用传感器实现对纤维素酶活的检测,需要在检测范围的拓宽上有所提高,以及如果能够进一步解决生物物质的有效性和重复性等一些技术问题,人们将更广泛的接受并运用这一技术。在已有的相关工作基础上,为今后研制出生产实践过程中纤维素酶酶活在线快速测定方法提供了一定意义和指导作用,有望研制出类似血糖监测传感器的快速、方便的商业化传感器,运用于实践中。