植物次生代谢(secondarymetabolism)是由初生代谢(primary metabolite)派生的一类特殊代谢过程[1](见图1),是植物在长期进化中与环境相互作用的结果。近来的研究发现,植物次生代谢物(sec-ondarymetabolite)在植物生命活动的许多方面均起着重要作用,且部分是植物生命活动所必需的[2]。例如,吲哚乙酸、赤霉素直接参与生命活动的调节;木质素为细胞次生壁的重要组成成分;叶绿素、类胡萝卜素等萜类物质作为光合色素参与光合作用过程等[3]。随着次生代谢产物在医药、食品、轻化工等领域的广泛应用,其物质的种类、代谢途径,以及代谢机理等相关问题亦倍受研究者关注,是植物生理学、植物化学等众多学科的主要研究内容之一。植物次生代谢物的产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。目前其分类方法主要有如下三种:①根据化学结构不同,分为酚类、萜类和含氮有机物等[4];②根据结构特征和生理作用不同,分为抗生素(植保素)、生长刺激素、维生素、色素、生物碱与植物毒素等;③根据其生物合成的起始分子不同,分为萜类、生物碱类、苯丙烷类及其衍生物等三个主要类型。笔者将按第三种分类方法对其物质种类、代谢类型等方面的研究进展进行概述。

1　萜类化合物

萜类化合物(perpenoid)是所有异戊二烯聚合物及其衍生物的总称[6],以异戊烷五碳类异戊二烯为基本单位,又称类异戊二烯( isoprenoid),以侧链重复连接方式递增,分开链类和环萜类两种。开链型类萜的分子组成通式为(C5H8)n,包括半萜(C5,即含一个异戊二烯单位,n=1)、单萜(C10,n=2)、倍半萜(C15,n=3)、双萜(C20,n=4)、三萜(C30,n=6)、四萜(C40,n=8)、多萜(>C40,n>8)及杂萜(含异戊二烯侧链)等。环萜型类萜因分子内碳环数的不同,可分为单环萜、双环萜、三环萜等。半萜、单萜及其简单含氧衍生物是挥发油的主要成分;双萜是形成树脂的主要成分;倍半萜是萜类的最大一族,约有7000多种,作用广泛;二萜、三萜多以皂甙形式存在。双萜类以上也称“高萜类化合物”,一般不具挥发性。植物萜类广泛分布于植物、微生物的初级代谢物和次级代谢物中[7]。

1. 1　萜类化合物的生物合成萜类化合物的生物合成过程从属于异戊二烯代谢途径,总体可分为四步:

(1)前体物质异戊烯焦磷酸( isopentenydiphosphate, IPP)的合成: IPP或二甲丙烯焦磷酸(dimethylallyl diphosphate, DMAPP, IPP的异构化产物)为萜类合成的基本前体,合成途径有两条,即甲羟戊酸途径(mevalonic acid pathway,MVA pathway)和甘油醛磷酸/丙酮酸途径(3-phosphate glyceralde-hydes/pyruvate pathway, or1-Deoxy-D-xylulose 5-phos-phate pathway,DXP pathway)(见图2)。

经典的MVA途径存在于胞质和内质网中, 3-羟基-3-甲基戊二酸单酰CoA还原酶(3-hydroxy-3-methyl-glutarylCoA reductase,HMGR)为该途径的第一个限速酶[8]; DXP途径存在于质体中,参与此途径的两个限速酶分别是1-去氧木糖-5-磷酸合成酶和1-去氧木糖-5-磷酸还原酶[9]。此外,线粒体亦可通过MVA途径产生泛醌异戊二烯基团,是第三类IPP生物合成区室。IPP合成途径的区室化特征可能与萜类代谢亚细胞水平特异性有关。

(2)异戊二烯焦磷酸同系物的产生: IPP在异戊烯基转移酶的作用下发生亲电子延伸反应,使相应的中产物通过C5单位头对尾、头对头等方式连续加成形成异戊烯焦磷酸同系物。如法呢基焦磷酸、=牛儿基焦磷酸、=牛儿=牛儿基焦磷酸等烯丙焦磷酸酯类物质,是构成各类萜化合物的直接前体。异戊烯基转移酶催化亲电耦合反应的过程为丙烯基焦磷酸酯首先离子化,再和IPP的末端双键反应形成一个第3位C的阳离子化合物,最后脱去一个质子完成反应。现阶段研究最为广泛的异戊烯基转移酶为法呢基焦磷酸合酶( farnesyl diphosphate syn-thase; )[10]。

(3)萜类基本骨架的构建:各类烯丙基焦磷酸酯经特异性萜类合酶作用可产生各种萜类的碳骨架,如植烯、鲨烯的形成等。

(4)骨架的次级酶修饰:萜类碳骨架合成后,需经过附加不同含氧官能团、共振结构和环化作用等次级修饰过程,才可赋予萜类物质结构多样性、化学性质复杂性,以及功能特异性等特征[11]。如(-)-柠檬烯在不同烯丙位上特异性引入一个氧原子,就会在辣薄荷中转化为(-)-薄荷醇,在留兰香中转变为(-)-香芹酮,二者分别为不同种植物精油的特征性成分。向萜类骨架引入氧原子的羟基化或环氧化反应,多由细胞色素P450多功能氧化酶催化完成。

1. 2　萜类化合物的代谢调控

植物次生代谢途径通常以不同类别的次生代谢物合成途径为单位即代谢频道(metabolic channel)的形式存在[12]。植物萜类化合物,如单萜、倍半萜以及双萜等高级萜类不仅拥有单独的合成途径,且具独特的酶促反应机制。例如,番茄果实甾醇和胡萝卜素的合成分别由不同的HMGR等位基因所控制[13];马铃薯中HMG1负责机械损伤诱导的甾醇合成,HMG2和HMG3则负责诱发因子作用下倍半萜植保素的合成[14]。萜类的代谢频道不仅受植物发育进程的调控[15],亦受不同诱发因子的启动[16-18]。如气候条件是影响萜类物质形成的重要因素之一,其种类、数量、含量和释放量都会随季节的变化而变化[19, 20],多数热带植物含有大量挥发油成分[21];亚热带松柏科植物树脂含量明显高于温带松柏科植物[22]。

此外,萜类代谢与植物营养水平有关[23]。Bry-ant等提出的“碳-营养平衡”假说认为,植物体内以C为基础的次生代谢物质(如萜类、酚类等)与以N为基础的次生代谢物质(如生物碱等)基本保持一种平衡关系[24]。在植物生长过程中,添加N可以导致以C为基础的次生代谢物质的减少[25],其中单萜类化合物受营养水平的影响更为显著[26-28]。病虫害侵袭能诱导植物产生更多的挥发性物质,或改变植物挥发性物质成分的含量及组分浓度比。如青蒿素单萜合成酶cDNA的转录可被伤诱导[29];华山松球果受害后,萜类各组分的含量明显增加[30]。萜类物质的变化有利于植株进行自我保护及防御病虫害的侵袭[31, 32]。

植物萜类化合物的生物合成受关键酶与限速酶的调控,如转移酶、合酶、环化酶等[33]。其中,关键酶的表达决定代谢途径的启动及相关特定物质的合成,而限速酶的表达则与物质的合成量相关。萜类合酶是萜类生物合成的关键酶,是研究萜类代谢途径的重点,目前主要研究方向为萜类合酶分子DNA序列分析。该酶具有多重特性,如一种植物中有多种萜类合酶基因[34, 35],其表达有时空特异性,在特定细胞和组织中表达,在生长发育的特定阶段表达,以及具防御反应诱导的瞬时表达等。但是,该合酶基因在植物中一般表达量较低,难于分离纯化。目前已从植物中得到约100个萜类合酶的cDNA,已具备从一级结构分析萜类合酶的基础[36]。HMGR、各种萜类环化酶、鲨烯合成酶是萜类代谢途径的限速酶。代谢频道内多个相关酶活性的协同提高,往往可显著地提高次生代谢物的产量。如McMullen等通过QTL分析发现玉米黄酮甙(flavone glycoside,又称maysin)的生物合成量的提高与各种酶活性的协同表达有关[37]。

近年来,人们已拓宽了对萜类化合物代谢工程的研究策略,利用增加萜类代谢途径中限速步骤酶编码基因的拷贝数,或通过反义RNA和RNA干涉等技术,以增加灭活代谢途径中具有反馈抑制作用的编码基因,在不影响细胞基本生理状态的前提下,阻断或抑制与目的途径相竞争的代谢流;利用已有的途径构建新的代谢旁路合成新的萜类化合物等。例如,将萜类代谢途径中的一系列关键酶基因导入大肠杆菌中可构建一条新的代谢途径,实现在无类胡萝卜素合成的大肠杆菌菌株中生成类胡萝卜素[38]。研究表明,部分大肠杆菌菌株经DXP途径可以合成少量的类胡萝卜素,通过基因工程增加此代谢途径中关键酶基因的拷贝数后其合成量明显提高[39, 40]。

2　生物碱

生物碱(alkaloid)属含氮有机次生代谢物中的最大一族,主要包括异奎啉类、吲哚类和多炔类等。大约20%的有花植物都能产生生物碱,目前已经分离到12 000余种,其中许多种类是药用植物的有效成分。如喜树(Camptotheca acuminata)中喜树碱为一种有效的抗癌药物;罂粟(Papaver somniferum )中可待因具有止痛、镇咳功效;金鸡纳树(Cinchona of-ficinalis)中奎宁为传统的抗疟疾药物,用来消除对其他抗疟疾药物产生的抗性;长春花(Catharanthusroseus)中长春花碱为抗肿瘤药物,可用于治疗淋巴瘤等。

2. 1　生物碱类化合物的生物合成

大多数生物碱分子都是由L-氨基酸(如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和精氨酸等)单独合成,或者与类固醇、类裂环烯醚萜(如次番木鳖苷)或其他类萜配基结合生成。根据合成前体不同,生物碱可分为真生物碱、伪生物碱和原生物碱。真生物碱和原生物碱都是氨基酸衍生物,但后者不含杂氮环,而伪生物碱则不来源于氨基酸,是由萜类、嘌呤和甾类化合物转化而来。普通氨基酸经三羧酸循环一两次转变即可成为具高度特异性的生物碱合成前体。

目前研究发现,植物生物碱的主要类型为萜类吲哚生物碱、苄基异喹啉生物碱、茛菪碱、烟碱和嘌呤生物碱等,这些生物碱在植物体内均有其特定的生物合成途径或代谢频道形式存在(见图3)。萜类吲哚生物碱分子含有吲哚环和次番木鳖苷。异胡豆苷合酶是该途径关键酶之一,其中产物异胡豆苷(strictosidine),是该途径重要的分支点,可进一步转化为长春花碱、奎宁、番木鳖碱等多种同类生物碱(图3:A途径);四氢苯基异喹啉类生物碱合成途径的分支点为(S)-网状番荔枝碱,在特异性合酶的作用下可进一步合成黄连素、延胡索碱、吗啡等生物碱(图3: B途径)。烟碱和茛菪碱等生物碱的合成前体为鸟氨酸,腐胺-N-甲基转移酶、托品酮还原酶、东茛菪胺羟基化酶等为该类物质生物合成的关键酶[42](图3:C途径)。

2. 2　生物碱类化合物的代谢调节

植物生物碱代谢途径是一个动态的复杂过程[43],既受到植物本身遗传背景和生长发育进程的调控,也受到病虫侵染和取食、生态环境、营养水平、养分形态等各种诱发因子刺激的作用。例如,氮素有利于植物生物碱产额的提高[44],反之,缺乏氮素则严重抑制生物碱的合成[45];氮素形态差异对生物碱的合成和积累也有影响,可导致生物碱含量或各组分比例的改变[46],但其影响机制,目前还知之甚少。

已知的植物生物碱代谢频道中,其代谢途径往往受到在空间、区域和底物上的高度特异酶的调控。例如,生物碱长春多灵的生物合成过程分别在细胞质、液泡、液泡膜、内质网膜、类囊体膜等5个以上细胞区室内完成。苯基异喹啉生物碱的合成途径中黄连素桥酶及(S)-四氢原黄连素氧化酶都定位在由光滑内质网产生的小泡中,是一种微小粒体细胞色素P450依赖型氧化酶,具有高度底物特异性[47]。吲哚-3-甘油磷酸裂解酶、酪氨酸/多巴脱羧酶、小檗碱桥酶等可能是各类生物碱合成途径的限速酶,决定着生物碱的合成与积累量。托品酮还原酶、小檗碱桥酶、氧甲基转移酶等为催化合成生物碱中特定立体结构基本骨架的专一性酶,而羟基化酶、脱氢酶和单氧化酶等修饰酶类,虽然对底物要求不高但可影响生物碱代谢的最终产物类型[48]。

植物次生代谢往往涉及多个酶基因的协同表达。增强关键酶基因转录因子或调节基因的拷贝数,可强化次生代谢多基因的协同表达,促进次生产物的合成,是植物次生代谢基因工程的新途径。目前,研究者已从长春花中分离得到茉莉酸诱导型的AP2区域转录因子ORCA3,该转录因子在长春花中的组成型表达,使得萜类吲哚生物碱关键酶的表达增强,目标产物合成量提高[49]。此外,通过强启动子与酶基因嵌合转化的基因添加方式也可提高控制特定生物碱合成的关键酶和限速酶的活性,例如将长春花中色氨酸脱羧酶和异胡豆苷合酶的嵌合基因连接到组成型启动子上,再转入长春花,转基因长春花培养细胞中萜类吲哚生物碱含量增加[50];强化转基因植物中与生物碱合成有关的酪氨酸/多巴脱羧酶和色氨酸脱羧酶基因的协同表达,可减少吲哚芥子油苷的含量,增加吲哚生物碱的含量[51]。

3　苯丙烷类化合物

苯丙烷类化合物(phenylpropanoid)或其衍生物广泛分布于约250 000种维管植物中,结构迥异,种类繁多,广泛参与调节生长发育、繁殖和防御等各种植物生理活动。

黄酮类化合物泛指由2个芳香环(A和B)通过中央三碳链相互连接而成的以苯色酮环为基础结构的一系列化合物,目前已发现4500多种异型分子,如花色素苷(色素)、原花色素或缩合鞣质(阻食剂或木材保护剂)、异黄酮类化合物(防御产物和/或信号分子)、查尔酮、橙酮、黄酮、黄酮醇等。简单酚类为含有一个羟基的苯环化合物,按其结构可分为3类,即①简单苯丙酸类(phenyl propanoid)化合物,具苯环-C3基本骨架,如t-桂皮酸( trans-cinnamic acid ), p-香豆酸( para-coumaricacid)、咖啡酸(caffeic acid)和阿魏酸( ferulic acid)等;②苯丙酸内酯(phenyl propanoic lactone)类化合物,亦称香豆素A(coumarin A)类,含苯环-C3基本骨架,但C3与苯环通过氧化方式环化,如伞形酮(umbelliforone),补骨脂内酯(psoralen lactone)和香豆素等;③苯甲酸(benzoid acid)衍生物类,具有苯环-C1基本骨架,例如水杨酸(salicylic acid)和香兰素(vanillin)等。许多简单酚类化合物在植物防御食草昆虫和真菌侵袭中起重要作用,某些成分还具有调节植物生长的作用。

醌类化合物是一类由苯式多环烃碳氢化物(如萘、蒽等)衍生的芳香二氧化物,是植物呈色因子之一。根据其环系统可分为苯醌、萘醌和蒽醌。部分醌类具有抗菌、抗癌等功效,如胡桃醌和紫草宁。

3. 1　苯丙烷类化合物的生物合成

苯丙烷类化合物生物合成的起始分子为芳香族氨基酸,即苯丙氨酸和酪氨酸。研究表明,在大多数植物苯丙烷类化合物代谢途径中包含两个基本途径,即莽草酸(shikimic acid)途径和丙二酸(malonicacid)途径[52]。莽草酸途径主要参与高等植物的苯丙烷类代谢,丙二酸途径则为真菌或细菌的合成途径。在高等植物体中,通过莽草酸途径可将赤藓糖4-磷酸(磷酸戊糖途径)与磷酸烯醇式丙酮酸(糖酵解途径)结合经中产物莽草酸(故名为“莽草酸途径”)转化为芳香族氨基酸———苯丙氨酸和酪氨酸。这两种芳香族氨基酸为苯丙烷类化合物生物合成的起始分子。由苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase,PAL)催化苯丙氨酸脱氨形成肉桂酸,进而转化为木质素单体(monolignol)的一系列过程被公认为苯丙烷类化合物代谢的中心途径(图4)。

3. 2　苯丙烷类化合物的代谢调节

苯丙烷中央代谢途径condensed tannin及类黄酮和异黄酮合成支路均以代谢频道存在[53-55]。例如,拟南芥细胞中的查耳酮合酶(chalcone synthase,CHS)、查耳酮异构酶(chalcone isomerase, CHI)、黄烷酮-3-氢氧化酮酶和二氢黄酮醇还原酶之间相互联系形成多酶复合体[56],黄烷酮-3-氢氧化酮酶、肉桂酸-4-羟基化酶、阿魏酰-5-羟基化酶等细胞色素P450酶多充当细胞膜“锚”的作用,将相关的酶组装固定在内质网膜上,从而构成了此类代谢途径的代谢频道[57, 58]。

研究表明,苯丙烷代谢途径中PAL、CHS、芪合酶、异黄酮合酶等为形成特定立体结构的专一性酶,对底物具有较强的专一性。在大多数维管植物中苯丙氨酸是PAL偏爱的底物,但只有单子叶植物的PAL才可以同时利用苯丙氨酸和酪氨酸。黄烷酮-7-O-甲基转移酶、异黄酮-4-O-甲基转移酶、异黄酮(异黄烷酮)二甲烯丙基转移酶等为该途径的结构修饰酶类。PAL、肉桂酸-4-羟基化酶(cinnamate 4-hydoxylase,C4H)、4-香豆酰-CoA-连接酶(4-coumar-ate CoA ligase, 4CL)是苯丙烷类合成途径中的限速酶,位于代谢途径的分支点或者合成途径的下游,负责合成广义酚类物质的一般合成前体。

PAL是一种诱导酶,可受到多种因素的诱导。如低温、机械损伤、病原菌感染、光、毒素处理、昆虫取食等都可诱导PAL基因的表达,王莉等利用不同光质条件对长鞭红景天悬浮培养细胞进行较长时间的辐射处理,并检测其PAL活性的变化,通过比较分析得知长时间的红光处理有利于PAL酶活的提高[59]。CHS是将苯丙烷类代谢途径引向黄酮类合成的第一个酶,该酶基因的表达也会受到病原菌的诱导,其活性受到植物激素、营养水平、光照、病原菌及机械损害等的影响。PAL位于初生代谢和次生代谢分界处,因此被定位为是苯丙烷类化合物代谢的中心酶。植物中,编码PAL的基因为单基因或一个多基因家族。分支酸(chorismic acid)是莽草酸途径的重要枢纽物质,将代谢分为色氨酸合成方向及苯丙氨酸(phenylalanine)和酪氨酸( tyrosine)合成方向。

日益成熟的植物基因工程技术和苯丙烷类代谢产物重要应用价值的不断阐明,促进了苯丙烷类代谢途径基因工程的研究。目前,主要的研究策略体现在关键酶基因工程及调节基因或转录因子基因工程等方面[60],为提高限速酶活性或引入新的苯丙烷类代谢途径奠定了理论和技术基础。例如,He等将IOMT基因与CaMV35S连接后转入苜蓿,可使其合成苜蓿素(medicarpin)的速度较对照快,产量高,抗病水平显著提高[61]。将花生芪合酶基因转入含反应底物的烟草细胞,可使外源基因表达并启动新途径合成芪类化合物,提高转基因植物的抗病水平。将拟南芥的IFS基因转入烟草和玉米等非豆科植物,可将柚皮素转化为染料木黄酮、大豆黄素(仅存在于豆科植物体中)等异黄酮类植保素[62-64]。此外,可通过反义基因的遗传转化抑制部分关键酶基因的表达,降低饲料和树木中木质素的含量,提高饲料的饲用价值和木材的造纸质量和效益[65],或通过CCoAOMT ( caffeoyl coenzyme A-3-O-methyltrans-ferase)反义基因的遗传转化,有效降低转基因烟草中木质素的含量[66]。

综上所述,植物次生代谢途径的基本框架已初步探明,在代谢途径分子调控及代谢工程的研究方面也已取得了不少进展,但是一些限速步骤及同功酶的研究资料较少,转基因植株有效成分的安全性及有效性还尚未明确。随着生物科学研究的深入,一些未知代谢机制将被进一步揭示,以为植物次生代谢的正确定位和药用植物资源保护与可持续利用方案的制定等奠定理论基础。