| 左旋四氢巴马汀对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤后海马CA1区Fas和F | | 关键字：损伤,对大,GH,KL,EF,CD,yz,AB,MN,OP, 发布时间：2011-08-21 |
医药导报２０１０年９月第２９卷第９期
?药物研究?
左旋四氢巴马汀对大鼠局灶性脑缺血一再灌注损伤后
海马ＣＡ，区Ｆａｓ和ＦａｓＬ蛋白表达的影响
马小亚１，武冬梅２，李
明３
（１．两安交通大学医学院第二附属医院药剂科，７１０００４；２．西安市儿奄医院，７１０００３；３．西安交通大学医学院组织
胚胎学教研室，７１００６１）
［摘要］目的探讨左旋四氢巴马汀（Ｌ－ＴＨＰ）对大鼠局灶性脑缺血－再灌注损伤的保护作用及对海马ＣＡ．区凋
亡蛋白Ｆａｓ、ＦａｓＬ表达的影响。方法参照改良Ｌｏｎｇａ法建立局灶性脑缺血－再灌注模型，应用ＩｍａｇｅＰｒｏＰｌｕｓ６．０专业图
像分析软件测定脑梗死体积，比色法测定肌酸激酶（ＣＫ）活力，用免疫组化法分别检测缺血侧海马ＣＡ．区Ｆａｓ、ＦａｓＬ阳性
表达。结果与模型组比较，Ｌ?ＴＨＰ能够缩小局灶性脑缺血一再灌注损伤大鼠脑梗死体积，降低血清ＣＫ活力。降低缺血
侧海马ＣＡ。区Ｆａｓ、ＦａｓＬ凋亡蛋白的表迭。结论Ｌ．ＴＨＰ可能通过抑制神经元凋亡蛋白Ｆａｓ、ＦａｓＬ表达，而对脑组织起到
保护作用。
［关键词］四氢巴马汀，左旋；脑缺血－再灌注损伤；脑保护作用；神经元凋亡蛋白
［中图分类号］Ｒ９７１．１；Ｒ７４３［文献标识码］Ａ［文章编号］１００４—０７８１（２０１０）０９一ｌｌｌ５—０５
ＴｈｅＥｆｆｅｃｔｓｏｆＬ－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐａｌｍａｔｉｎｅｏｎｔｈｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡｐｏｐｔｏｓｉｓＰｒｏｔｅｉｎＦａｓａｎｄ
ＦａｓＬｉｎＨｉｍｐｐｏｃａｍｐａｌＣＡ
ｌａｆｔｅｒＦｏｃａｌＣｅｒｅｂｒａｌＩｓｃｈｅｍｉａＲｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎＩｎｊｕｒｙｉｎ
Ｒａｔｓ
ＭＡＸｉａｏ－ｙａｌ，ｗＵＤｏｎｇ—ｍｅｉ２，ＬＩＭｉｎ９３（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ｔｈｅＳｅｃｏｎｄＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｃｈｏｏｌｏｆ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｘｉ７ａｎＪｉａｏｔｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉａｎ７１０００４，Ｃｈｉｎａ；２．ＸｉａｎＣｈｉｌｄｒｅｎｓＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｘｉ７ａｎ７１０００３，Ｃｈｉｎａ；
３．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｉｓｔｏｌｏｇｙａｎｄＥｍｂｒｙｏｌｏｇｙ，ＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｘｉ。ａｎＪｉａｏｔｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｔ’ａｎ７１００６１，
Ｃｈｉｎａ）
ＡＢＳＴＲＡＣＴ
Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ
ＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＬ—ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐａｌｍａｔｉｎｅ（Ｌ?ＴＨＰ）ｏｎｆｏｃａｌｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａ
ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｙｉｎｒａｔｓａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓｐｒｏｔｅｉｎＦａｓａｎｄＦａｓＬｉｎｈｉｍｐｐｏｃａｍｐａｌＣＡｌ．
ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｄｉｆｉｅｄｌＪ０ｎｇａ
ｍｅｔｈｏｄｗａｓｅｍｐｌｏｙｅｄｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈｔｈｅａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌｏｆｆｏｃａｌｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ，ＩｍａｇｅＰｒｏＰｌｕｓ６．０ｓｏｆｔｗａｒｅｗａｓｕｓｅｄ
ｔｏｄｅｔｅｃｔｖｏｌｕｍｅｏｆｃｅｒｅｂｒａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ，ｃｒｅａｔｉｎｅｋｉｎａｓｅ（ＣＫ）ｌｅｖｅｌｗａｓｅｘａｍｉｎｅｄｂｙｅｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ，ａｎｄｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｍｅｔｈｏｄｗａｓａｐｐｌｉｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅＦａｓａｎｄＦａｓＬｅｘｐｒｅｓｓｅｄｃｅｌｌｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ
Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｍｏｄｅｌｃｏｎｔｒｏｌ，Ｌ—ＴＨＰｄｅｃｒｅａｓｅｄｉｎｆａｒｃｔ
ｖｏｌｕｍｅ，ＣＫａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｒｅｄｕｃｅｄｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆＦａｓａｎｄＦａｓＬｉｎｈｉｍｐｐｏｃａｍｐａｌＣＡｌａｆｔｅｒｆｏｃａｌｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａｒｅｐｅｆｆｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｙ
ｉｎｒａｔｓ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＬＴＨＰｈａｓｔｈｅｐｍｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｏｎｆｏｃａｌｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｙｂｙｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｎｅｕｒｏｎ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓｐｒｏｔｅｉｎＦａｓａｎｄＦａｓＬ．
ＫＥＹＷＯＲＤＳ
Ｌ－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐａｌｍａｔｉｎｅ；Ｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｙ；Ｃｅｒｅｂｒａｌｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔ；Ａｐｏｐｔｏｓｉｓｐｒｏｔｅｉｎ
ｏｆｕｅｌｖｅ‘：ｅＵ
脑血管疾病是严重威胁人类生命健康的常见疾病
之一，其中缺血性脑血管病发病人数较多，约占脑血管
疾病患者的７０％。脑缺血损伤可以导致迟发性神经
元死亡（ＤＮＤ）。研究表明，神经元凋亡在ＤＮＤ的发
展过程中起重要作用，Ｆａｓ、ＦａｓＬ是凋亡诱导家族的重
［收稿日期］２００９—０８—２１［修回日期］２００９—０９—２８
［基金项目］‘陕西省科学技术研究发展计划项目［基金编
号：２００８Ｋ１３－０２（２）］
［作者简介］马小－哑（１９６５一），女，陕西绥德人，副主任药
师，硕士生导师，硕士，研究方向：临床药理学。电话：０２９—
８７６７９２５０，Ｅ，ｍａｉｌ：ｍｘｙ９１６＠１６３．ｃｏｍ。
要成员之一，两者的结合是细胞凋亡的重要调节机
制。“。左旋四氢巴马汀（Ｌ—ｔｅｔｒａｈｙｄｍｐａｌｍａｔｉｎｅ，Ｌ．
ＴＨＰ）作为镇痛、镇静、催眠药物已应用临床多年，基础
研究发现，Ｌ—ＴＨＰ是植物性钙离子阻滞药，具有抗心肌
缺血、减轻大鼠全脑缺血一再灌注损伤及减少神经元凋
亡的作用。笔者在本实验研究Ｌ—ＴＨＰ对局灶性脑缺
血一再灌注损伤的保护作用及对神经元凋亡蛋白Ｆａｓ、
ＦａｓＬ表达的影响。
１材料与方法
１．１实验动物健康ＳＤ品系大鼠１６０只，平均体质
量（２４０＋２０）ｇ，雌雄兼有，由西安交通大学动物实验
万方数据
换页
?１１１６?ＨｅｒａｌｄｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅＶ０１．２９Ｎｏ．９Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ２０１０
中心提供，实验动物生产许可证号：ＳＣＸＫ（陕）２００７．
００１。
１．２药物与试剂
受试药物：左旋四氢巴马汀（罗通
定片，湖南洞庭药业股份有限公司提供，批号：０７０６０９，
每片含Ｌ．ＴＨＰ３０ｍｇ），实验前以纯化水配成０．４％，
０．２％，０．１％的混悬液，临用前用涡旋混合器混匀后使
用。阳性对照药：尼莫地平片（正大青春宝药业有限
公司生产，批号：０７０９８７，每片含尼莫地平２０ｍｇ），以
纯化水配成０．１％的混悬液。１０％水合氯醛（西安交
通大学医学院第二附属医院制剂室生产）。肌酸激酶
（ＣＫ）试剂盒（南京建成生物工程研究所提供）；兔抗
鼠Ｆａｓ、ＦａｓＬ多克隆抗体、山羊抗兔ＩｇＧ抗体及免疫组
化ＤＡＢ显色剂（北京奥博森生物技术有限公司提供。
１．３仪器ＳＤ－７８型双极电凝器（上海医用电子仪器
厂）。ＵＶ－２５５０紫外可见分光光度计（日本岛津公司）。
ＡＯ组织切片机（美国ｏｐｔｉｃａｌ公司）。ＰＹＸ—ＤＨＳ隔水式
电热恒温培养箱（上海市跃进医疗器械厂）。ＦＭ包埋
箱（上海福玛实验设备有限公司）。ＯｌｙｍｐｕｓＢｘ４０型光
学显微镜（日本Ｏｌｙｍｐｕｓ株式会社）。Ｑ５５０ＣＷ图像信
号采集与分析系统（德国ＬＥＩＣＡ公司）。
１．４实验动物分组与给药方法①将６０只大鼠随机
分为６组，每组１０只。假手术组、模型组给予纯化水
１０ｍＬ?ｋｇ～，阳性对照组给予尼莫地平溶液
１０ｍｇ?ｋｇ一，低、中和高剂量药物组给予Ｌ—ＴＨＰｌ０，２０，
４０ｍｇ?ｋｇ～。在缺血２ｈ再灌注６ｈ测定脑梗死体积
和血清ＣＫ活力。②将１００只大鼠随机分为５组，假
手术组、模型组给予纯化水１０ｍＬ?ｋｇ～，阳性对照组
给予尼莫地平溶液１０ｍｇ?ｋｇ～，中和高剂量药物组给
予Ｌ—ＴＨＰ２０，４０ｍｇ?ｋｇ～，每组根据缺血一再灌注时间，
分别缺血２ｈ再灌注６，１２，２４，４８ｈ，合计２０小组。免
疫组化法测定Ｆａｓ、ＦａｓＬ的阳性表达。各组动物连续
灌胃给药５ｄ，ｑｄ，再灌注期间连续给药。
１．５模型的制备大鼠局灶性脑缺血一再灌注模型的
制备采用Ｌｏｎｇａ法稍作改良心ｊ，建立大鼠大脑中动脉
阻塞（ＭＣＡＯ）局灶性脑缺血一再灌注模型：麻醉大鼠，
于颈部左侧做切口，在颈外动脉（ＥＣＡ）剪－－ｄ，口，将
线栓自ＥＣＡ经颈总动脉（ＣＣＡ）分叉处插入颈内动脉
（ＩＣＡ），将线栓推至大脑中动脉（ＭＣＡ），待大鼠麻醉清
醒后，若观察到行走时向右侧转圈即认为符合实验的
入组标准，到各灌注时间拔出线栓，实行再灌注。假手
术组仅将尼龙线放入ＥＣＡ，不进入ＩＣＡ。
１．６血清ＣＫ活力测定采用摘眼球法，取大鼠新鲜
血液２ｍＬ，待血清析出后，３０００ｒ?ｍｉｎ‘１（ｒ－－１５ｅｍ）离
心１０ｒａｉｎ。取上层血清约１ｍＬ，装于具塞离心管中，
参照ＣＫ试剂盒说明书，按步骤操作，室温下用紫外分
光光度计测定各组吸光度（Ａ值），计算ＣＫ活力。
１．７脑梗死体积测定将进行完眼球取血的大鼠迅
速断头处死，取出全脑，一２０℃速冻１０ｍｉｎ，去除嗅球、
小脑和低位脑千，然后将脑从额极至枕极连续冠状切
片，每２ｍｍ一张，共５或６片。将脑切片放入１％
，ｒｒｃ磷酸缓冲液中，在３７℃水浴箱中温孵３０ｍｉｎ，用
１０％多聚甲醛固定２４ｈ后，将固定的脑片按切片顺序
排列，数码相机摄相。利用ＩｍａｇｅＰｒｏＰｌｕｓ６．０专业图
像分析软件测出每个脑片梗死面积，梗死体积＝梗死
面积Ｘ厚度（２ｍｍ），并将所得数值相加得全脑梗死灶
体积的近似值。
１．８标本采集和组织切片的制备将缺血一再灌注不
同时间段的大鼠，用１０％水合氯醛３ｍＬ?ｋｇ。１腹腔麻
醉，暴露心脏，用灌注器经心尖、左心室插入到主动脉
内，先用０．９％氯化钠溶液，然后改用４％多聚甲醛灌
注、固定大鼠约１ｈ，灌注完毕后，取出全脑去除嗅球、
小脑及低位脑干后，冠状切取海马区脑组织，浸于原固
定液２４ｈ（４℃）后，取出流动水冲洗２４ｈ，再将冲洗后
的脑组织经８５％乙醇浸泡脱水以备石蜡切片。经常
规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋，切片，用于
Ｆａｓ、Ｆａｓｌ免疫组化染色。
１．９图像分析及采集
免疫组化染色后在４００倍光
学显微镜下，在大鼠缺血侧海马ＣＡ．区随机选取５个
视野进行观察，以细胞内出现鲜亮的棕黄色颗粒为阳
性细胞。并记录Ｆａｓ、ＦａｓＬ阳性细胞表达总数，取其平
均值。然后采用图像信息采集与分析系统采集图片。
１．１０统计学方法实验数据以均数±标准差（ｉ±ｓ）
表示，采用ＳＰＳＳｌ３．０统计软件进行分析，两组以上计
量数据比较采用单因素方差分析（ｏｎｅ—ｗａｙ，ＡＮＯＶＡ），
其中两两比较采用ＬＳＤ检验，Ｐ＜０．０５表示差异有显
著性。
２结果
２．１大鼠脑梗死体积和血清ＣＫ活力的检测结果
ＴＴＣ染色后观察到，正常组织呈红色，梗死灶呈苍白
色，界限明显。假手术组脑组织均匀红染无梗死灶，其
他各组非缺血侧染色基本呈红色，脑缺血一再灌注后脑
梗死体积明显增大，缺血侧模型组梗死范围最大，其他
给药组梗死范围有不同程度的缩小。与模型组比较，
阳性对照组、高剂量药物组的脑梗死体积明显减少
（Ｐ＜０．０１），而低剂量和中剂量药物组脑梗死体积虽有
所缩小，但差异无显著性。可见Ｌ—ＴＨＰ可以缩小由于
局灶性脑缺血一再灌注损伤造成的脑梗死体积。模型
组与假手术组比较，大鼠脑缺血一再灌注后血清ＣＫ活
万方数据
换页
医药导报２０１０年９月第２９卷第９期
?１ｌ１７?
力明显升高（Ｐ＜Ｏ．０１）。与模型组比较，阳性对照组、
中剂量和高剂量药物组血清ＣＫ活力明显降低（Ｐ＜
０．０１）。低剂量药物组ＣＫ活力虽有所降低，但差异无
显著性。说明Ｌ－ＴＨＰ具有降低局灶性脑缺血一再灌注
大鼠血清ＣＫ活力的作用。见表１。
表１Ｌ．ＴＨＰ对局灶性脑缺血．再灌注大鼠脑梗死体积、血
清ＣＫ活力的影响
Ｔａｂ．１ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＬ．ＴＨＰｏｎｖｏｌｕｍｅｏｆｃｅｒｅｂｒａｌ
ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎａｎｄｓｅｒｕｍＣＫａｃｔｉｖｉｔｙａｆｔｅｒｆｏｃａｌｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａ－
ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｒａｔｓ
ｉ＋ｓ
缉别
大鼠／
剂量／脑梗死体积／
ＣＫ／
４…
只
（ｍｇ?ｋｇ。）
（ｍｍ３）（ｇ?Ｌ。）
高剂馈药物组
ｌＯ４０１７３．０±５３．８“１．６±０．４“
中剂量药物组
ｌＯ２０２５５．１±５７．２２．３±０．７“
低剂苗药物组
１０１０２８２．２＿＋２７．５２．８±０．４
阳性对照组
ｌＯ１０
１８０．１－＋５８．１“１．０＋０．３“
模型组
１０
…
２９４．０±７２．８“３．３＋０．４也
假于术组
１０…０．０土０．００．９±Ｏ．１
与模型组比较，“Ｐ＜Ｏ．０１；与假手术组比较，～Ｐ＜Ｏ．Ｏｌ
Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ，“Ｐ＜０．０ｌ；Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈ
ｔｈｅｓｈａｍｏｐｅｒａｔｉｏｎｇｒｏｕｐ，“Ｐ＜０．０１
２．２大鼠神经元Ｆａｓ蛋白表达情况与假手术组比
较，模型组中海马ＣＡ，区Ｆａｓ的阳性细胞表达在各灌
注时间段均明显增加（Ｐ＜０．０１）。在脑缺血２ｈ再灌
注６ｈ阳性表达就开始增多，随着再灌注时间的延长，
在再灌注２４ｈ时Ｆａｓ的阳性细胞表达数相对６，１２ｈ
有所增多，达到高峰，在４８ｈ降低。与模型组比较，阳
性对照组，中剂量和高剂量药物组在海马ＣＡ。区Ｆａｓ
的阳性细胞表达在各灌注时间均有所减少，差异有显
著性或极显著性（Ｐ＜Ｏ．０５或Ｐ＜Ｏ．０１）。说明Ｌ—ＴＨＰ
能减少局灶性脑缺血一再灌注损伤大鼠海马ＣＡ。区Ｆａｓ
的阳性细胞表达。与阳性对照组比较，中剂量和高剂
量药物组在降低大鼠局灶性脑缺血一再灌注后海马
ＣＡ．区Ｆａｓ阳性细胞表达方面差异无显著性。见表２。
光学显微镜下观察到缺血侧假手术组海马ＣＡ，区可见
散在少量Ｆａｓ阳性细胞表达，模型组可见主要表达在
胞质和胞核的淡棕色的弱阳性颗粒沉积。其余各干预
组见少量淡棕色的阳性细胞。见图１。
２．３大鼠神经元ＦａｓＬ蛋白表达情况脑缺血一再灌
注后，模型组在缺血２ｈ再灌注６ｈ开始ＦａｓＬ阳性细
胞有明显表达，在再灌注２４ｈ时表达的阳性细胞数明
显增多，达到高峰，在４８ｈ开始趋于降低。与假手术
组比较，海马ＣＡ。区ＦａｓＬ的阳性细胞表达在再灌注６，
１２，２４ｈ均明显增加，差异有显著性或极显著性（ＪＰ＜
０．０５或Ｐ＜０．０１），再灌注４８ｈ组虽然ＦａｓＬ蛋白阳性
表达数增多，但差异无显著性。说明局灶性脑缺血一再
表２Ｌ－ＴＨＰ对局灶性脑缺血－再灌注大鼠海马ＣＡ。区Ｆａｓ阳性细胞表达的影响
Ｔａｂ．２ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＬ－ＴＨＰｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＦａｓ－ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｅｌｌｓａｆｔｅｒｆｏｃａｌｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ
ＣＡ，ａｍｏｆｒａｔｓｉ±ｓ
。。
大鼠／
剂量／
海马ＣＡ，【）（Ｆａｓ孵ｊ性细胞数
…。
只（ｍｇ．ｋｚ一１）
６ｈ１２ｈ２４ｈ４８ｈ
高剂最药物组
２０４０
４．７±０．６“６．７－．１．５”６．０±０．３“５．１±０．２“
中剂量药物组
２０２０
６．０±０．５“７．０±０．４”８．０±０．４“９．０＋１．６ｎ
阳性对照组
２０ｌＯ５．Ｏ－ｖＯ．６“６．０±０．２“
６．０±０．９“４．８－＋０．２“
模型组
２０
…
１１．０±０．７”１４．０＋０．６”１６．Ｏ±１．４“１１．０±１．６妇
假手术组
２０
…
３．０±０．２４．０＋０．３７．Ｏ±０．３４．０±０．４
与模型组比较，“Ｐ＜０．０１，“Ｐ＜０．０５；与假手术组比较，”Ｐ＜０．０１
Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ，“Ｐ＜Ｏ．０１，”Ｐ＜Ｏ．０５；Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｓｈａｍｏｐｅｒａｔｉｏｎｇｒｏｕｐ，”Ｐ＜０．Ｏｌ
ＡＢ
Ｃ
ＤＥ
图１各组再灌注２４ｈ海马ＣＡ，区ＦＡＳ免疫组化染色（×４００）
Ａ：假手术组；Ｂ．模型组；Ｃ．阳性对照组；Ｄ．高剂量药物组；Ｅ．中剂量药物组
Ｆｉｇ．１
ＩｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｔａｉｎｉｎｇｉｎｏｆＦＡＳｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌＣＡｌａｎ组ａｔ２４ｈａｆｔｅｒｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ（ｘ４００）
Ａ．ｓｈａｍｏｐｅｒａｔｉｏｎｇｒｏｕｐ；Ｂ．ｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ；Ｃ．ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｄｒｕｇｇｒｏｕｐ；Ｄ．ｈｉｇｈｄｏｓｅｄｒｕｇｇｒｏｕｐ；Ｅ．ｍｅｄｉｕｍｄｏｓｅｄｒｕｇｇｒｏｕｐ
万方数据
换页
?１１１８?ＨｅｒａｌｄｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅＶ０１．２９Ｎｏ．９Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ２０１０
灌注损伤能够引起脑组织ＦａｓＬ的阳性表达。与模型重要的临床意义。因线栓法ＭＣＡＯ模型具有不开颅、
组比较，阳性对照组在各灌注时间均能降低海马ＣＡ，损伤小、效果稳定且可准确控制缺血及再灌注时间的
区ＦａｓＬ的阳性细胞表达，在再灌注２４ｈ作用显著（Ｐ＜
优点而被认为是脑缺血－再灌注损伤的标准模型＂Ｊ。
０．０１），各给药干预组中，高剂龟药物组在海马ＣＡ，区实验采用严格的动物实验纳入标准和１Ｔｒｃ染色结合
ＦａｓＬ的阳性表达在灌注６，１２，２４ｈ时均有明显的减的方法，双莺标准验证ｒ脑缺血动物模型是否合格。
少，差异有显著性或极显著性（Ｐ＜Ｏ．０５或Ｐ＜０．０１），在脑缺血引起脑血流阻断后，短期的脑组织缺血后
再灌注４８ｈ时虽有所减少，但差异无显著性。说明应再灌注可以减轻缺血引起的脑损伤，但长时间的缺血
用Ｌ—ＴＨＰ４０ｍｇ?ｋｇ‘１能够降低局灶性脑缺血－再灌注恢复血液灌流后不但不能恢复其功能和结构，反而加
损伤后脑内ＦａｓＬ的阳性表达，在缺血－再灌注早期作重其功能障碍和结构损伤。目前多认为ＭＣＡＯ缺血
用显著。与阳性对照组比较，中剂量和高剂量药物组
９０—１８０ｍｉｎ为理想的缺血时间【４］。本实验在预实验
差异无显著性。说明阳性对照组与中剂量和高剂量药期间通过１Ｔｒｃ染色分别比较在缺血１，２，３ｈ时，脑组
物组降低局灶性缺血一再灌注大鼠脑内ＦａｓＬ阳性表达织梗死面积的大小，发现缺血１ｈ脑梗死面积较小，缺
方面差异无显著性。见表３。光学显微镜下观察到缺
血２ｈ时梗死面积增大，且比较稳定，３ｈ时可以获得
血侧假手术组海马ＣＡ，区可见散在分布表达ＦａｓＬ蛋最大的梗死面积。通过比较缺血．再灌注后动物的死
白的阳性细胞，模型组海马ＣＡ，区明显观察到棕黄色亡率，发现缺血２ｈ再灌注４８ｈ动物的死亡率为１３％，
分布的阳性细胞，表现为细胞固缩、深染、结构不清，细
缺血３ｈ再灌注４８ｈ后动物的死亡率达到３９％，因此
胞膜或胞质有棕黄色颗粒沉积，以细胞膜阳性颗粒沉本实验选择缺血２ｈ既满足了缺血一再灌注后治疗所要
积最为明显。其余各给药干预组ＦａｓＬ阳性细胞数明求的最佳治疗时间窗，又能提高实验的成功率，可以有
显减少。见图２。效反映Ｌ—ＴＨＰ抗局灶性脑缺血一再灌注损伤的治疗效
３讨论果及能更好的研究Ｌ—ＴＨＰ保护脑缺血?再灌注损伤的
临床缺血性脑血管病中，６０％患者为大脑中动脉机制。
闭塞，因此研究ＭＣＡＯ所造成的脑缺ｆｆＩＬ疾病具有十分７ｒｒｃ染色腑梗死体积测量是研究药物对脑血管疾
表３Ｌ－ＴＨＰ对局灶性脑缺血一再灌注大鼠海马ＣＡ。区ＦａｓＬ阳性细胞表达的影响
Ｔａｂ．３ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＬ－ＴＨＰｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＦａｓＬ－ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｅｌｌｓａｆｔｅｒｆｏｃａｌｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ
ＣＡ．ａｒｅａｏｆｒａｔｓｉ±ｓ
高剂苗药物组
２０４０６．１±０．９”９．５±０．７“１３．７±２．３“１４．２±２．９
中剂量药物组
２０
２０１２．２±３．６
１４．８＋２．０１５．０＋１．６“１２．３±２．０
阳性对照组
２０１０１０．３±２．５
１２．４±１．６１３．４＋１．７“
１２．６±２．２
模型组
２０
…
１１．３士０．８“１８．４＋２．１”２５．８－＋３．４“
１５．２±２．１
假手术组
２０
…
６．２±１．２８．７－＋１．６６．２±１．３９．３－＋１．９
与模型组比较，“Ｐ＜０．０５。一Ｐ＜０．Ｏｌ；与假手术比较，“Ｐ＜０．０５，“Ｐ＜０．Ｏｌ
Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ，‘１Ｐ＜０．０５，’２Ｐ＜０．０１；Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｓｈａｍｏｐｅｒａｔｉｏｎｇｒｏｕｐ，＋３Ｐ＜Ｏ．０５，’４Ｐ＜Ｏ．０１
ＡＢ
Ｃ
ＤＥ
图２各组再灌注２４ｈ海马ＣＡｌ区ＦａｓＬ免疫组化染色（）＜４００）
Ａ．假手术组；Ｂ．模型组；ｃ．阳性对照组；Ｄ．高剂量药物组；Ｅ．中剂量药物组
Ｆｉｇ．２ＩｎｎｎｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｔａｉｎｉｎｇｏｆＦａｓＬｉｎｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌＣＡｌ
ａｒｅａａｔ２４ｈａｆｔｅｒｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ（×４００）
Ａ．ｓｈａｍｏｐｅｒａｔｉｏｎｇｒｏｕｐ；Ｂ．ｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ；Ｃ．ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ；Ｄ．ｈｉｇｈｄｏｓｅｄｒｕｇｇｒｏｕｐ；Ｅ．ｍｅｄｉｕｍｄｏｓｅｄｒｕｇｇｒｏｕｐ
万方数据
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医药导报２０１０年９月第２９卷第９期
－１ｌ１９?
病疗效的常规方法，是神经保护药物基础研究的重要
评价指标，具有简捷、直观的特点。其基本原理：ＴＴｃ
（２，３，５一氯化三苯基四氮唑）是一种脂溶性光敏感复合
物，它是呼吸链中吡啶．核苷结构酶系统的质子受体，
与正常脑组织中的脱氢酶反应而罨深红色脂溶性物
质，而梗死组织内因脱氢酶活性下降，不能反应，故不
显色而呈苍白色。实验中通过１ＴｒＣ染色测定脑组织
梗死体积发现，假手术组未见脑梗死灶，脑片成均匀红
染。模型组腑梗死体积最大，在冠状切片中，以第３片
脑片梗死范围最大，这与大脑中动脉所支配的供血区
域相吻合。实验结果表明Ｌ—ＴＨＰ可以挽救因缺血引
起的缺血半暗带内的细胞，缩小由于局灶性脑缺血一再
灌注损伤造成的脑梗死体积，起到神经保护的作用。
ＣＫ是一种细胞内酶，主要分布在骨骼肌，其次为
脑组织和心肌。研究认为，血清ＣＫ一样可以作为脑
内神经细胞损害的特异性生化指标，当脑组织受到损
伤时，ＣＫ活力增加一。。本实验结果湿示Ｌ—ＴＨＰ具有
降低局灶性脑缺血一再灌注大鼠血清ＣＫ活力的作用，
从生化角度间接反映Ｌ—ＴＨＰ对局灶性脑缺血再一灌注
损伤的脑组织具有保护作用。
Ｆａｓ属于肿瘤坏死因子受体家族成员，为凋亡刺激
因子，其配体是细胞凋亡因子ＦａｓＬ，Ｆａｓ、ＦａｓＬ是凋亡诱
导家族的重要成员之一。Ｆａｓ与ＦａｓＬ结合，可促发一
系列细胞内反应，最终导致靶细胞的Ｃａｓｐａｓｅ激活，凋
亡细胞增多：６】。本实验发现，脑缺血．再灌注损伤能够
引起腑组织Ｆａｓ、ＦａｓＬ的阳性细胞表达增多，应用Ｌ—
ＴＨＰ４０ｍｇ?ｋｇ。能够下调局灶性缺血．再灌注损伤后
脑内Ｆａｓ、ＦａｓＬ阳性细胞表达，减少局灶性脑缺血一再灌
注后神经细胞凋亡，这可能是其对脑缺血一再灌注损伤
保护机制之一。
脑缺血．再灌注损伤机制众多，目前大量的研究认
为Ｌ—ＴＨＰ可减少全脑缺血一再灌注损伤后神经元的死
亡，对脑缺血一再灌注损伤具有一定的保护作用。可能
通过在缺血一再灌注早期增加ＡＴＰ含量，减少乳酸产
生，降低神经元凋亡的发生＂１；阻断钙通道，减少钙超
载，抑制缺血．再灌注后脑组织钙聚集博ｏ；同时能够通
过减少自由基产生、抑制炎症反应【９。和减轻一氧化氮
（ＮＯ）介导的神经毒性¨毗等机制发挥对脑缺血．再灌
注损伤的脑保护作用。本实验通过选择局灶性脑缺
血一再灌注模型，在此基础上观察Ｌ—ＴＨＰ对脑缺血．再
灌注损伤后凋亡蛋白Ｆａｓ、ＦａｓＬ的影响，发现Ｌ－ＴＨＰ可
通过抑制神经组织内凋亡蛋白Ｆａｓ、ＦａｓＬ表达，减少细
胞凋亡的发生，从而改善局灶性脑缺血一再灌注损伤大
鼠脑梗死体积，降低ＣＫ活力，起到脑组织保护作用。
［ＤＯＩ］１０．３８７０／ｙｙｄｂ．２０１０。０９。００１
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